IC50计算方法.docx

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1、IC50计算方法IC50是指反应被抑制一半时抑制剂的浓度，这里的反应可以是酶催化反应、抗原抗体反应等。在凋亡方面，可以理解为一定浓度的某种药物诱导肿瘤细胞凋亡50%,该浓度称为50%抑制浓度，即凋亡细胞与全部细胞数之比等于50%时所对应的浓度，IC50值可以用来衡量药物诱导凋亡的能力，即诱导能力越强，该数值越低,当然也可以反向说明某种细胞对药物的耐受程度。半抑制浓度(或称半抑制率)，即IC50o在间接竞争ELISA标准曲线中是一个非常重要的数据，标准曲线是一个S型曲线。ICELISa中，不添加抑制物质的对照孔的OD值为BO,添加了抑制物质的孔的OD值为BBBO%就叫做结合率，在结合率为50%时

2、所对应的抑制物质的浓度就叫做IC50o一般IC50的数值越小，说明你的抗体的特异性能越强！最小检测限为试剂盒标准曲线的最小的浓度，小于最小浓度或大于最大浓度，即不在曲线范围内的都不准确，大于最大浓度可以稀释后测。IC50为50%抑制浓度即BB0=50%时所对应的浓度，半数抑制是用来衡量抗体灵敏度的半数抑制越低，说明抗体的灵敏度越高。通常来说，试剂盒最大和最小量程应该是该抗体用来检测标准品的检测限，检测限分最大和最小检测限。检测下限一般为理论值，是根据标准曲线算出来的理论上可以检测到的最小的值；定量限为实际检测时可以定量的最低的值；而最大检测限就是实际操作中抑制率达到100%时的药物浓度。检测下

3、限(LOD)对应的OD值:OD(LOD)=BO-3SD定量限(LOQ)对应的OD值：OD(LOQ)=BO-IOSD酶活力单位(U,activeunit)酶活力的度量单位。1961年国际酶学会议规定：1个酶活力单位是指在特定条件（25,其它为最适条件）下，在1分钟内能转化1微摩尔底物的酶量，或是转化底物中1微摩尔的有关基团的酶量。酶活力单位：用来表示酶活力大小的单位，通常用酶量来表示。其中一个称酶活力国际单位，规定为：在特定条件下，1分钟内转化1微摩尔底物，或者底物中1微摩尔有关基团所需的酶量，称为一个国际单位（IU,又称U）。另外一个国际酶学会议规定的酶活力单位是Kat,规定为：在最适条件下，

4、1秒钟能使1摩尔底物转化的酶量。Kat和U的换算关系：1Kat=6107U,l=16.67nKat酶的比活力（specificactivity）:是指每毫克质量的蛋白质中所含的某种酶的催化活力。是用来度量酶纯度的指标。是生产和酶学研究中经常使用的基本数据。酶的转化数（KCat）:在单位时间内每一活性中心或每分子酶所能转换的底物分子数。生产中并不常用抑制剂和酶的结合速度要看情况而定，主要和你的抑制剂有关，许多情况下结合得很快，但是也有slowbindinginhibitor（我最近做的一个就是，抑制剂和酶的平衡时间很长，中途加根本看不出变化，必须吧抑制剂和酶一起incubate15分钟，然后用底

5、物引发）.如果只是IC50,一个底物浓度就够了。但是IC50会随底物浓度的变化而变化，所以你要指定一个底物的浓度，发表IC50的时候要注明你底物的浓度。这个浓度如果没有任何依据的随意指定一个，感觉上就会不专业。如果你已经有其它人关于这个酶和其它抑制剂的资料（并且上面详细注明了所用的酶和底物的浓度，还有对底物的Km）,你当然可以省事的在其它人的底物浓度下测你的IC50o不过如果你没有详细的相关资料或者不很肯定查到的相关数据，最好是先自己做一下这个酶的动力学曲线。具体怎么做动力学找本书上就有了。简单的就是根据相关资料（新的酶就要看自己的感觉了）设计几个底物浓度，然后调整加的酶的浓度使得所有速度曲线

6、在引发后的几分钟都是线性的，而且前几分钟消耗的底物量一定不要超过底物总浓度的10%底物的浓度你要高高低低地试几次，然后估算出Km的大致值（加许多底物让酶饱和，这个时候测出的速度应该是VmaX,Km就是使得速度为VmaX一半的时候的底物浓度）。然后你设计10-15个底物浓度点上及5倍Km,下及1/5Km,注意Km附近点要密集些因为正是曲线的拐弯处。情况好的话你就会拿到那个酶的Michaelis-Menten曲线（X轴底物浓度Y轴速度），处理后得到Km和Kcato我觉得最后指定的测IC50的底物浓度要么是Km，要么是3Km或5xKm（饱和）。当然如果你有决心的话，最好是做个关于抑制剂的全动力学以得

7、出Kio具体的方法就是选58个底物浓度点，然后在每个底物浓度下测46个抑制剂浓度的反应速度，我一般是为保准确每个数据点重复23次，工作量不小，但是Ki不受其它因素影响，直接表征抑制剂对酶的结合能力，是适合发表的正式数据一、原理曝理兰，简称MTT,可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的Formazan结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚飒（DMSO）溶解,用酶联免疫检测仪在49Onm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。二、试剂材料准备与实验仪器1）对数生长期细胞2）受试因素（药物）3 ）MTT:以PBS配制成5mg.mlz抽虑除菌，保存

8、在4?C4 ）DMSO（二甲基亚飒）5 ）96孔板6 ）酶联免疫检测仪7 ）细胞培养箱三、实验步骤（实用于贴壁细胞）1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孑版，l104孔，细胞浓度可以调整。2 ）置37oCx5%CO2温箱培养使细胞贴壁。3 ）加入不同浓度的药物，如L5、10、40、50、80、160、320mgml的药物，时间依据实验需要,一般3天。4 ）小心吸去上清，PBS轻轻洗涤，再次离心，弃上清。5 ）每孔加入180Ul新鲜RPMI1640培养液，再力口入20ulMTT溶液（5mg/mlz即0.5%MTT）,继续培养4ho6 ）终止培养（可离心，1000rpm,10min）,小

9、心吸去孔内培养液。7 ）每孔加入150Ul二甲基亚碗（也可以用酸化异丙醇，10%SDS代替），置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪49Onm处测量各孔的吸光值。8 ）同时设置调零孔（培养基、MTT.二甲基亚飒），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTTx二甲基亚飒），每组设定3复孔。三、结果统计学处理所有数值以s表示，应用SPSS软件进行方差分析，p0.05时为相差显著，p0.01时为相差非常显著。可以以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生线，专门公式求IC50。或计算抑制率。四、注意事项与常见问题1）实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、M

10、TT,二甲基亚飒。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTT.二甲基亚飒，不同的是对照加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。2）每孔中的细胞数可以根据细胞生长的速度调整，并进行预实验调整浓度，太多敏感性降低，太少观察不到差异。3 ）贴壁细胞加MTT前吸掉培养液，悬浮细胞可以不吸除培养液,再加入0.5%MTTz量为20ul孔。4 )如果不使用96孔板，培养基超过IOOml,MTT按照10%的比例加入。5 )MTT一般4度保存两周，注意避光保存，或配制成5mgml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解，配制完后可过滤一下。6 )对于DM

11、SO,溶解后呈紫(红)色，490nm有最大吸收值；而对于SDS和酸化异丙醇，则选用570nm,并且建议以655nm作为参考波长。7 )96孔板在培养箱中，由于湿度不够，而培养箱由于具有一定的温度，使得边缘的孔水分蒸发较快，导致培养基中各种成分浓度变化增大，导致细胞状态不同。对于这种现象，要保证培养箱中的湿度，减少开关培养箱的次数和时间。8 )注意细胞悬液一定要混匀，已避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不等，可以每接几个就要再混匀一下。9 )没有去掉上清直接加DMSO,沉淀会很难溶解。加DMSO前要把液体吸掉，但培养液里的紫色结晶可能会吸去，也可在倒之前先用平板离心机离心96孔板，2000r

12、,5分钟，然后吸掉上清。加入DMSO后可用排枪反复抽吸助溶，溶解后尽快检测。10 )为了减少误差，培养板的四边孔只加培养基或只接种细胞，而不作为指标检测孔。11)除置摇床上低速振荡10min,使结晶物充分溶解外，可用枪头吹打，加快溶解，效果亦可；或放入37度放孵箱15分钟溶解结晶。12 )关于如何计算IC50方法有多种改良寇式法:1g法50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)(2)BliSS法:自己查阅书籍(3) IC50计算软件，见下面附件（4）自己用EXCEL做趋势线来求IC50,关于LD50的方法与此相似！（5）在线求IC50或EC50:http:/chiryo.phar.nagoy

13、a-cu.ac.jp/javastat/JavaStat-j.htm13 ）计算抑制率，公式（对照-本底）-（给药-本底）/（对照-本底）*100%.MTT试验的一些细节问题（一）细胞L选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有105个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。14 药物浓度的设定。一定要多看文献

14、，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。15 时间点的设定。在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。16 培养时间。200ul的培养液对于10的45次方的增殖期细胞来说，很难维持68h,如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向GO期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。17 MTT法只能测定细胞相对数和相对活力，不能测

15、定细胞绝对数。做MTT时，尽量无菌操作，因为细菌也可以导致MTT比色OD值的升高。18 理论未必都是对的。要根据自己的实际情况调整。19 实验时应设置调零孔，对照孔，加药孔。调零孔加培养基、MTTx二甲基亚飒。对照孔和加药孔都要加细胞、培养液、MTTs二甲基亚飒，不同的是对照孔加溶解药物的介质，而加药组加入不同浓度的药物。8,避免血清干扰。用含15%胎牛血清培养液培养细胞时，高的血清物质会影响试验孔的光吸收值。由于试验本底增加，会试验敏感性。因此，一般选小于10%胎牛血清的培养液进行。在呈色后，尽量吸净培养孔内残余培养液。（二）实验步骤贴壁细胞：L收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入IoOUI,铺板使待测细胞调密度至IoOO-IOOOO孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。2.5%CO2,37。C孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔IOOuLiS3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况3.5%CO2,37。C孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。4 .每孔加入20UlMTT溶液（5mgml,即0.5%MTT）,继续培养4h0若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，