超氧化物歧化酶.ppt

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1、SOD知识简介知识简介1.SOD的概念的概念 超氧化物歧化酶是一种广泛存在于动物、植物、微生物中的超氧化物歧化酶是一种广泛存在于动物、植物、微生物中的金属酶，是生物体内抗氧化酶系中主要成员之一。金属酶，是生物体内抗氧化酶系中主要成员之一。2.SOD的分类的分类 按其结合的金属离子可分为按其结合的金属离子可分为Fe-SOD、Mn-SOD、CuZn-SOD三种三种SOD知识简介知识简介3.SOD的理化性质的理化性质 3.1 SOD对氰化物和对氰化物和H2O2的敏感性的敏感性 长时间用过氧化氢处理可使长时间用过氧化氢处理可使 CuZn-SOD 和和 Fe-SOD失活，而失活，而Mn-SOD不受影响不

2、受影响3.2 SOD的吸收光谱特性的吸收光谱特性 CuZn-SOD具有独特的紫外吸收光谱。由于色氨酸和具有独特的紫外吸收光谱。由于色氨酸和酪氨酸的含量较低，它在酪氨酸的含量较低，它在280 nm处并没有最大吸收峰。处并没有最大吸收峰。CuZn-SOD的可见光最大吸收波长都在的可见光最大吸收波长都在680 nm左右，左右，这反映了酶分子中这反映了酶分子中Cu2+的光学特性。的光学特性。SOD知识简介知识简介3.3 SOD稳定性及影响因素稳定性及影响因素3.3.1 PH、热、蛋白酶的影响：、热、蛋白酶的影响：SOD在在pH5.39.6间催化性能间催化性能良好，在良好，在pH4.5pH11间能稳定存

3、在。间能稳定存在。pH3.6时，时，CuZn-SOD中中95%的的Zn要脱落，在要脱落，在pH12.2时，时，SOD的构象会发生不可逆的的构象会发生不可逆的转变而使酶失活。转变而使酶失活。3.3.2 SOD对热的稳定性与溶液中离子强度有关。当离子强度对热的稳定性与溶液中离子强度有关。当离子强度很低时很低时,即使加热到即使加热到95,其活性损失也很少其他因素：其活性损失也很少其他因素：SOD活活性受饮料的色泽、成分、酸碱度、乙醇含量等多种因素的影响，性受饮料的色泽、成分、酸碱度、乙醇含量等多种因素的影响，只有在无色、近中性、无乙醇饮料中只有在无色、近中性、无乙醇饮料中SOD活性较稳定。另外还活性

4、较稳定。另外还发现有机溶剂和发现有机溶剂和Cl对对SOD的活性具抑制作用的活性具抑制作用SOD的作用的作用welcome to use these PowerPoint templates,New Content design,10 years experience 它催化超氧阴离子转化为它催化超氧阴离子转化为H2O2和和O2的反应，的反应，即催即催化超氧阴离子自由基化超氧阴离子自由基O2-发生歧化反应，发生歧化反应，从而清除从而清除O2-，2O2-+2H+H2O2+O2，在生命体的自我保护系统中起在生命体的自我保护系统中起着极为重要的作用，着极为重要的作用，在免疫系统中也有重要的功，因而在免

5、疫系统中也有重要的功，因而它能防御氧毒性，增强机体抗辐射损伤能力，防衰老。它能防御氧毒性，增强机体抗辐射损伤能力，防衰老。实训目的实训目的（1）掌握）掌握SOD酶的提取、分离、检测一般步骤。酶的提取、分离、检测一般步骤。2）了解酶在提取过程中的两个参数：回收率、纯）了解酶在提取过程中的两个参数：回收率、纯化倍数。化倍数。3）掌握离心机的使用。）掌握离心机的使用。实训原理实训原理welcome to use these PowerPoint templates,New Content design,10 years experience 邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化，释放出邻苯三酚在碱性条

6、件下，能迅速自氧化，释放出 O2-，生成带色的中间产物，中间物的积累在滞留，生成带色的中间产物，中间物的积累在滞留3045s后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在后，与时间成线性关系，一般线性时间维持在4min的的范围内，中间物在范围内，中间物在420nm波长处有强烈光吸收。波长处有强烈光吸收。当有当有SOD存在时，由于它能催化存在时，由于它能催化O2-与与H+结合生成结合生成O2和和H2O2，从而阻止了中间产物的积累，因此，通过测，从而阻止了中间产物的积累，因此，通过测定光吸收即可求出定光吸收即可求出SOD的酶活性。的酶活性。实训器材实训器材welcome to use these Pow

7、erPoint templates,New Content design,10 years experience 大蒜，冷丙酮大蒜，冷丙酮 ，磷酸缓冲液（磷酸缓冲液（PH7.8，0.05mol/L)氯仿氯仿-乙醇混合液乙醇混合液 邻苯三酚邻苯三酚 浓盐酸仪器：浓盐酸仪器：天平、天平、石英砂、石英砂、研钵、研钵、冷冻离心机、冷冻离心机、50mL离心管离心管 （8）、）、紫外紫外-可见分光光度计、可见分光光度计、250mL三角瓶三角瓶（8个）、个）、玻璃棒玻璃棒 （8根）、根）、试剂瓶试剂瓶250mL（3个）、个）、500mL （3个）、个）、250mL烧杯烧杯 （16个）、试管带胶个）、试管带胶

8、塞塞(80根根)、移液管、移液管(5根根)SOD的生产的生产1.SOD酶的提取酶的提取 称取称取5克大蒜蒜瓣，加入石英砂研磨破碎细胞后，克大蒜蒜瓣，加入石英砂研磨破碎细胞后，加入加入pH7.8,0.05mol/L的磷酸缓冲液（的磷酸缓冲液（pH7.8）15ml，继，继续研磨续研磨20min,使使SOD酶充分溶解到缓冲液中，然后酶充分溶解到缓冲液中，然后6000r/min冰冻离心冰冻离心15min，放弃沉淀，取上清液。，放弃沉淀，取上清液。2.去除杂蛋白去除杂蛋白 上清液中加入上清液中加入0.25倍体积的氯仿倍体积的氯仿乙醇混合液搅拌乙醇混合液搅拌15min,6000r/min离心离心15min

9、，放弃沉淀，得到的上清，放弃沉淀，得到的上清液即是粗酶液液即是粗酶液SOD的生产的生产3.SOD酶的沉淀分离酶的沉淀分离 粗酶液在搅拌下缓慢加入固体硫酸铵至饱和浓度粗酶液在搅拌下缓慢加入固体硫酸铵至饱和浓度60%，持续搅拌持续搅拌15min，6000r/min离心离心15min，得到，得到SOD酶沉酶沉淀淀4.将沉淀溶入将沉淀溶入pH7.8，0.05mol/L的磷酸缓冲液的磷酸缓冲液5mL中，中，然后然后6000r/min离心离心15min，放弃沉淀，取上清液，用，放弃沉淀，取上清液，用凝胶凝胶sephacylS-200进行纯化，然后超滤浓缩。进行纯化，然后超滤浓缩。SOD的生产的生产5.用紫

10、外分光光度计测定浓液的蛋白含量用紫外分光光度计测定浓液的蛋白含量6.将浓缩冷冻干燥后即得成品。将浓缩冷冻干燥后即得成品。连苯三酚自氧化速率的测定连苯三酚自氧化速率的测定 取取4.5ml缓冲液，在缓冲液，在25水浴中保温水浴中保温15min,加入加入10 连苯连苯三酚液，迅速摇匀三酚液，迅速摇匀 空白：取空白：取4.5ml缓冲液，在缓冲液，在25水浴中保温水浴中保温15min,加入加入10 缓冲液，迅速摇匀缓冲液，迅速摇匀 倒入光径倒入光径1cm的比色杯中，在的比色杯中，在325nm波长下于恒温池中波长下于恒温池中每隔每隔30s测测A值一次值一次 计算线形范围内，每计算线形范围内，每1minA的

11、增值，此即连苯三酚的自的增值，此即连苯三酚的自氧化速率，要求自氧化速率控制在氧化速率，要求自氧化速率控制在0.07OD/min酶活测定酶活测定测定方法与测连苯三酚自氧化速率相同测定方法与测连苯三酚自氧化速率相同取取1.5ml缓冲液，在缓冲液，在25水浴中保温水浴中保温15min,加入加入3ml酶液，加入酶液，加入10 连苯三酚液，迅速摇匀连苯三酚液，迅速摇匀空白：取空白：取1.5ml缓冲液，在缓冲液，在25水浴中保温水浴中保温15min,加入加入3ml酶液，加入酶液，加入10 缓冲液，迅速摇缓冲液，迅速摇匀匀计算加酶后连苯三酚自氧化速率计算加酶后连苯三酚自氧化速率SOD的生产的生产试剂试剂/m

12、l空白空白管管对照管对照管OD1提取液提取液OD2粗酶液粗酶液OD2酶液酶液OD2PH8.3缓冲液缓冲液33333SOD提取液提取液000.10.10.1蒸馏水蒸馏水21.81.71.71.7室温放置室温放置20min邻苯三酚邻苯三酚00.20.20.20.2结果计算结果计算酶活力单位酶活力单位 提取液酶活力单位：提取液酶活力单位：=2（OD1-OD2）5/0.1=粗酶液活力单位：粗酶液活力单位：=2（OD1-OD2）5/0.1=酶液活力单位：酶液活力单位：=2（OD1-OD2）5/0.1=总活力总活力 提取液总活力提取液总活力U=活力单位总体积活力单位总体积=粗酶液总活力粗酶液总活力=活力单

13、位总体积活力单位总体积=酶液总活力酶液总活力=活力单位总体积活力单位总体积=比活力比活力 提取液酶液比活力提取液酶液比活力U/mg=活力单位活力单位/蛋白质浓度蛋白质浓度=粗酶液比活力粗酶液比活力U/mg=活力单位活力单位/蛋白质浓度蛋白质浓度=酶液比活力酶液比活力U/mg=活力单位活力单位/蛋白质浓度蛋白质浓度=注意事项注意事项welcome to use these PowerPoint templates,New Content design,10 years experience1.SOD的安全性的安全性 大量试验和临床应用表明，大量试验和临床应用表明，无论何种给药方式，除罕无论何种给药方式，除罕见的超敏反应外，见的超敏反应外，SOD对人体无毒性。虽然对人体无毒性。虽然SOD是是Mr在在30 000以上的蛋白质，以上的蛋白质，但却未发现具有抗原性，但却未发现具有抗原性，其原因其原因也正在进一步研究中。也正在进一步研究中。2.SOD生产时的注意事项生产时的注意事项2.1 在破碎细胞时要注意安全，一定要破碎的彻底在破碎细胞时要注意安全，一定要破碎的彻底2.2 PH的控制力度很重要，以及在实验中的温度等的控制力度很重要，以及在实验中的温度等 2.3 要学会正确使用分光光度计要学会正确使用分光光度计