酶学分析技术.ppt

1酶学分析技术酶学分析技术2 酶的活性酶的活性是指酶的催化能力的大是指酶的催化能力的大小，即酶促反应速度的快慢。在规定小，即酶促反应速度的快慢。在规定条件下，单位时间内底物减少的量或条件下，单位时间内底物减少的量或产物生成的量来表示。产物生成的量来表示。3 酶活性的单位酶活性的单位是指在特定的条是指在特定的条件下，使酶促反应达到某一速度所件下，使酶促反应达到某一速度所需要的酶量。需要的酶量。41.1.惯用单位惯用单位 由方法的作者自己规定在某特定由方法的作者自己规定在某特定 条件下生成一定量的产物为一个单位。条件下生成一定量的产物为一个单位。2.2.国际单位（国际单位（IUIU）在规定的实验条件下，每分钟催在规定的实验条件下，每分钟催 化化1 1molmol底物发生反应的酶量。底物发生反应的酶量。3.Katal3.Katal 1 Katal 1 Katal是指在最适宜的条件下，是指在最适宜的条件下，每秒钟催化每秒钟催化1mol1mol底物发生反应的酶量。底物发生反应的酶量。5 酶的比活性酶的比活性是指单位质量（是指单位质量（mgmg）的蛋白质所具有某种酶的活性。的蛋白质所具有某种酶的活性。活性单位活性单位/mg/mg蛋白蛋白 比活性比活性是衡量酶纯度的一个指标。是衡量酶纯度的一个指标。6酶活性单位的计算酶活性单位的计算酶单位酶单位/升升=（A测-A对）.V总.106 K.L.V标规定保温时间规定保温时间实际保温时间实际保温时间7酶促反应进程曲线酶促反应进程曲线产物浓度产物浓度反应时间反应时间t线性期线性期(B)偏离线性期（偏离线性期（c）8VmSVm/2Km一级反应一级反应混合级反应混合级反应零级反应零级反应酶促反应底物动力学酶促反应底物动力学9 Vmax S 米米-孟氏方程式：孟氏方程式：V=Km+S 1.v=VS/Km+S2.Km=S(V/v-1)3.Km 在一定的底物、在一定的底物、pH、温度下是一个常数温度下是一个常数(种类及底物性质有关种类及底物性质有关)4.酶促反应酶促反应亲和力亲和力1/Km6.设计适宜的底物浓度设计适宜的底物浓度10-20 Km5.选择酶的最适底物选择酶的最适底物11Km和和Vmax的测定的测定(双倒数法双倒数法)1 Km+S Km 1 1=vVmax SVmax S.+Vmax121S1VVmax1斜率斜率=VmaxKm-Km1双倒数作图法双倒数作图法13酶活性测定的方法酶活性测定的方法1.1.终点法终点法（又称二点法、固定时间法）（又称二点法、固定时间法）酶促反应一定时间后（从酶促反应一定时间后（从t t1 1到到 t t2 2)终止酶促反应，然后测定产物生终止酶促反应，然后测定产物生 成的量或底物消耗的量。成的量或底物消耗的量。14 优点优点 酶促反应已终止，比色计无需恒酶促反应已终止，比色计无需恒温装置，不必考虑显色剂对酶的影响。温装置，不必考虑显色剂对酶的影响。缺点缺点 无法了解酶作用这段时间里反应无法了解酶作用这段时间里反应是否外于线性期。是否外于线性期。15 每隔一定时间（每隔一定时间（10106060秒）连续测定酶秒）连续测定酶促反应中某一产物或底物变化量称为连续监促反应中某一产物或底物变化量称为连续监测法。测法。优点优点 容易找到线性期、结果可靠、容易找到线性期、结果可靠、省时、省时、省试剂、省样品省试剂、省样品缺点缺点 反应速度易受温度、反应速度易受温度、pHpH、底物浓度、底物浓度等因素的影响。等因素的影响。2.2.连续监测法（又称速率法）连续监测法（又称速率法）16 酶学分析酶学分析是将酶作为试剂的一种是将酶作为试剂的一种分析技术，它包括：分析技术，它包括：1.1.借助酶来测定某化合物借助酶来测定某化合物 2.2.借助酶来测定另一种酶借助酶来测定另一种酶特点：特点：专一专一 高效高效 灵敏灵敏 温和温和工工 具具 酶酶17 在许多酶促反应中，底物或产物的在许多酶促反应中，底物或产物的变化量很难直接测定，常需要在反应体变化量很难直接测定，常需要在反应体系中加入一种或一种以上的酶作为试剂。系中加入一种或一种以上的酶作为试剂。使第一个酶促反应的产物转变为易于检使第一个酶促反应的产物转变为易于检测的第二个酶或第三个酶的底物，通过测的第二个酶或第三个酶的底物，通过这种偶联反应间接测定第一个酶的待测这种偶联反应间接测定第一个酶的待测物浓度或待测酶的活性，这种作为试剂物浓度或待测酶的活性，这种作为试剂用的酶称为用的酶称为工具酶工具酶。A B C PA B C P18酶偶联测定法酶偶联测定法A B C PEX Ea EiLDH、MDH、G6PD、GLDH作工具酶均是作工具酶均是以以NAD（P）H为辅酶的脱氢酶。为辅酶的脱氢酶。P+NAD(P)H+H+PH2+NAD(P)+19 将水溶性的酶，通过物理或化学将水溶性的酶，通过物理或化学的方法，使其吸附、包埋或共价结合的方法，使其吸附、包埋或共价结合在固相载体上，成为不溶于水但仍保在固相载体上，成为不溶于水但仍保留催化活性的酶的衍生物称为留催化活性的酶的衍生物称为固相酶固相酶。优点：优点：可反复使用可反复使用 机械强度大机械强度大 稳定性好稳定性好 抗干扰性强抗干扰性强 20 名称名称 室温室温 4 -204 -20乳酸脱氢酶乳酸脱氢酶 7 7 30 7 7 30 天冬氨酸氨基转移酶天冬氨酸氨基转移酶 2 14 302 14 30丙氨酸氨基转移酶丙氨酸氨基转移酶 2 14 302 14 30肌酸激酶肌酸激酶 0.3 0.6 20.3 0.6 2碱性磷酸酶碱性磷酸酶 0.5 6 6000.5 6 600淀粉酶淀粉酶 2 60 602 60 60几种酶的稳定性（天）几种酶的稳定性（天）21同工酶的产生机理同工酶的产生机理v不同基因位点编码不同基因位点编码v等位基因编码等位基因编码v多条肽链化学修饰产生多条肽链化学修饰产生22 电泳法电泳法层析法层析法免疫化学法免疫化学法动力学法动力学法热失活法热失活法同工酶的分离及鉴定同工酶的分离及鉴定24血浆酶的来源血浆酶的来源血浆特异的酶血浆特异的酶 凝血酶类、纤溶酶类凝血酶类、纤溶酶类外分泌的酶外分泌的酶 淀粉酶类、脂肪酶类、碱性磷酸酶类淀粉酶类、脂肪酶类、碱性磷酸酶类细胞内酶细胞内酶 ALTALT、ASTAST、LDHLDH25酶活性测定在临床诊断中的应用酶活性测定在临床诊断中的应用n在肝脏疾病诊断中的应用在肝脏疾病诊断中的应用 ALTALT、ASTAST、LCATLCAT、OCTOCT、ICDICD、GLDHGLDH、SDHSDH、5 5-NT-NT、-GT-GT、ALPALP、MAOMAO 特异性强、活性高的酶特异性强、活性高的酶 n在急性心肌梗死诊断中的应用在急性心肌梗死诊断中的应用 ASTAST、LDHLDH、CKCK（心肌酶）（心肌酶）n在急性胰腺炎诊断中的应用在急性胰腺炎诊断中的应用 淀粉酶和脂肪酶淀粉酶和脂肪酶26n在骨骼疾病诊断中的应用在骨骼疾病诊断中的应用 ALP n在肌肉疾病诊断中的应用在肌肉疾病诊断中的应用 AST、CK、LDH、ALDn在前列腺疾病诊断中的应用在前列腺疾病诊断中的应用 ACPn在肿瘤诊断中的应用在肿瘤诊断中的应用27（一）样品（一）样品 1.1.溶血溶血 2.2.抗凝剂抗凝剂 3.3.样品存放的时间和温度样品存放的时间和温度（二）测定条件（二）测定条件 1.1.温度温度 2.pH2.pH 3.3.缓冲液的性质缓冲液的性质影响酶活性测定的因素影响酶活性测定的因素