鸡群免疫指标设计及方法.docx

鸡群免疫指标设计及方法1.外周血CD3+、CD4+CD8+淋巴细胞比值测定分别于免疫后7d、14d、21ds28d和35d每组选取6只鸡，每只心脏无菌采血L5ml/只0.2ml肝素抗凝，由于2ml的血液别离出来的淋巴细胞数目不够，所以把两只鸡的血液混合后别离淋巴细胞。在无菌环境下，用等量PBS液稀释，小心叠加于3ml淋巴细胞别离液面上，2000rmin离心25min,收集中间云雾层，PBS液洗涤两次,每次2000r/min离心5min,用PBS调整细胞浓度至l×107个/ml,参加50l的细胞到1.5ml的离心管中。分别参加荧光标记的抗体FrrC-CD3每106细胞lgj、PE-CD4每106细胞0.1gJ及PECY5-CD8每106细胞0.1g共10l,按照上述方法操作，同时做阴性对照同型对照o4。C避光孵育30min后,在4。C条件下，2000r/min离心5min,弃去上清液，按照上述方法用PBS洗涤2次，调整其体积为500l,用FACSCahbUr流式细胞仪检测。2血液淋巴细胞活性的测定使用按照3.2步骤常规制备鸡淋巴细胞,使其终浓度为0.5×106个/ml或0.25×106个/ml,铺于96孔细胞培养板中。每孔参加100L细胞悬液、用完全培养基补足200l孔，每个样品设6个重复孔，5%Co2、37。C培养44h后,每孔参加MTT10l(5gml,继续培养4ho吸出150l上清，参加150lDMSO,混匀。用酶联免疫检测仪，于OD570nm波长，测定吸光度。3疫苗抗体水平测定分别于免疫前0d)和免疫后(10d,17d、24d、31dx38d),固定选取30只鸡，采血ImI,37。C放置2h后，4。C冰箱放置过夜。3000rmin离心IOmin,每份分装为3个离心管。按常规方法用96孑LV形血凝板进行血凝抑制(HI)试验,血清抗体的血凝抑制效价以Iog2表示。1%鸡红细胞悬液的配制和抗体效价检测方法见中国兽药典2010版第三部附录12-14o4雏鸡免疫器官指数的测定各组在免疫后38d各随机抽取15只，称重，剖杀摘取法氏囊、脾脏、胸腺。用滤纸吸去外表的水分后，用分析天平称重，根据与体重之比计算法氏囊指数、脾脏指数和胸腺指数，计算公式如下：脾脏指数二脾脏重(mg)/体重(g)法氏囊指数二法氏囊(mg)/体重(g)胸腺指数=胸腺mg/体重g5血清细胞因子IL-2的检测用新城疫和禽流感H9抗体水平测定中别离的血清检测10只鸡/组。