华南师范大学实验报告.docx
以尽量减少与空气的接触（如右图）。三、材料、试剂和器具（一）材料饥饿16h的鸡（二）试剂（实验室已制备）1、10%鸽酸钠溶液2、l3molL硫酸溶液3、标准葡萄糖溶液（0. ImgZmL）（三）器具1、烧杯2、试管及试管架3、玻璃棒4、FOIin-吴宪式血糖管华南师范大学实验报告学生姓名林鸿锦学号20070004002专业综合理科二班年级、班级07级课程名称生物化学实验实验项目FOlinTU法测定血液葡萄糖含量实验类型口验证口设计口综合试验时间2008年11月10日实验指导老师陈文利实验评分一、目的学会用FOIin-WU法测定血液中葡萄糖含量。二、原理葡萄糖的半缩醛羟基具有还原性，在加热条件下可使碱性铜试剂中的Cu"还原为黄色的氧化亚铜沉淀，而其本身被氧化为峻基。氧化亚铜可使磷铝酸还原成蓝色的铜蓝，蓝色的深度与葡萄糖的浓度成正比，故可用比色法测定铝蓝的光吸收值来测定葡萄糖的浓度。3Cu2+2Mo0af6CuO+Mo2Oa（氧化亚铜）（锢蓝）血糖即指血液中存在的葡萄糖。由于血液中成分复杂，尤其有许多种蛋白质存在，它们对血糖的测定会产生干扰。因此，目前常用鸨酸法处理抗凝血来制备无蛋白滤液，然后用来测定无蛋白滤液中的葡萄糖含量。Na2WO.,+H2SO4-H2WO1+Na2SO4（鸨酸钠）（钙酸）F1在测定过程中，由于空气中的氧对Cu20会产生再氧化作用从而影响_测定结果，因此实验中要采用特制的福林一昊宪血糖管一一有一细颈，可l2.Sml8充米Folin-吴宪式血糖管4、碱性铜试剂5、磷钥酸试剂6、草酸钾（A.R）5、小漏斗6、可见光分光光度计7、移液管8、电炉四、实验过程（一）制备无蛋白滤液1、杀鸡取血后立即按2g草酸钾/L血液的比例加入草酸钾，以制备抗凝血。2、取一支试管加入7.5mL蒸馈水。3、用移液管量取0.5InL抗凝血。小心擦去管外血液后，于试管底部缓缓放出血液。吸取试管内蒸锵水吹洗吸管数次后，充分摇匀，使血液完全溶血。注意不要使血液粘附于移液管管壁。4、加入1/3InOI/L硫酸溶液ImL,边加边摇，摇匀后放置5min,5、过滤、收集滤液。由于第一次滤液不清，于是重新过滤，直到滤液澄清。至此，所制得的无蛋白滤液为20倍稀释的无蛋白血滤液，即每mL血滤液相当于含血0.05mLo（二）血糖的测定取血糖管3支，编号后按下表操作。（单位：mL）血糖管编号1（空白管）2（标准管）3（测定管）蒸储水2.0一一无蛋白血滤液一一2.0标准葡萄糖液一2.0一碱性铜溶液2.02.02.0混匀，沸水浴中煮8min,勿摇动取出，流水冷却。溶液颜色蓝色（无CwO生成）黄色（生成CihO）黄绿色（CihO较少）磷铝酸试剂2.02.02.0蒸储水19.019.019.0充分混匀。溶液颜色无色（无呢2。3生成）深蓝色（生成M02O3）蓝色（M02O3较少）A2l0.0000.4630.283At>2o20.0000.4600.280平均值0.0000.4620.282比色杯误差0.0000.001-0.007修正值0.0000.4610.289（三）血糖浓度计算每100mL血液所含葡萄糖I年数=%我A62oX标准葡萄糖I隼数X也公式分析：（1）式中0.1表示2mL血滤液相当于OJmL全血，即2mL滤液所含葡萄糖mg数/0.I=ImL全血所含葡萄糖mg数。（2）测定管A标准管A62o=2mL滤液所含葡萄糖mg数2mL标准葡萄糖mg数。（3）要求的是前100nlL全血所含葡萄糖Ing数，所以乘以100o综上，可得到上面的公式。将数据代入公式，则每IOomL鸡血所含葡萄糖mg数=(0.289/0.461)×0.2×(1000.1)=125.4mg<)五、实验讨论(一)注意事项21、欲得准确结果,所取血液的量必须准确。如果由吸管中放出血液的速度太快,会有大量血液粘在吸管内壁,容量不准,所以一般放出InIL血液所用的时间不应少于Imin.2、沉淀由鲜红变为暗棕色,是因鸨酸钠与硫酸作用生成鸨酸,在适当酸度时,使血红蛋白变性,沉淀。如血沉淀放置后不变为棕红色或重滤后仍混浊，可在鸽酸与血混合液中加入10%硫酸12滴,待变为暗棕色后再滤。(二)本实验中新鲜鸡血为什么要加入草酸钾？3血液凝固是一系列生物化学的结果，其最后阶段是血浆中的一种可溶性的纤维蛋白原转化为不溶性的纤维蛋白。参与凝血反应的物质统称为凝血因子,其中绝大部分属于蛋白质类,但也有小分子物质，如钙离子(CaD在血液凝固过程中起重要作用，缺乏则血液不能凝固。化学物质草酸钾(或草酸核)溶液能与血液中的钙离子发生发应，形成草酸钙沉淀，因此能起到抗凝作用。另外，柠檬酸钠也可与血液中的钙离子发生发应，结合成不易电离的络合物,防止血液凝固。(三)本实验采用的FoIinTU法测定血液中葡萄糖的含量，是一种比较老的测定方法，其缺点是显而易见的，例如需要制备无蛋白血滤液，操作麻烦，时间过长，而且其特异性不高。那么，有没有更好的实验方法呢？41、葡萄糖氧化酶法葡萄糖氧化酶(glucoseoxidase,GOD)利用氧和水将葡萄糖氧化为葡萄糖酸，并释放过氧化氢。过氧化物能(PeroXidase,PoD)在色原性氧受体存在时将过氧化氢分解为水和氧，并使色原性氧受体4-氨基安替比林和酚去氢缩合为红色酿类化合物，即TrindCr反应。红色醍类化合物的生成量与葡萄糖含量成正比。2、邻甲苯胺法在热的醋酸溶液中，葡萄糖醛基与邻甲苯胺缩合、脱水，生成希夫氏碱(SChiffbase),经分子重排生成蓝绿色化合物，其颜色深浅在一定范围内与血糖浓度成正比。邻甲苯胺+葡萄糖。葡萄糖基胺O希夫式碱=蓝绿色化合物比较这两种方法的优缺点：方法优点缺点邻甲苯胺法易于操作，特异性高邻甲苯胺腐蚀性、刺激性较高，且有毒性葡萄糖氧化酶法更易操作，无毒无刺激成本较高，试剂易污染，可操作性低【参考文献】1许秀珍，梁山.生物化学与分子生物学实验指导M.广州：暨南大学出版社，2003.82-842 http:Z3 4 http:WWWjpkc2007lcswhxshyjxshjc09.doc
