慢病毒感染protocol.docx

慢病毒载体感染流程（带噂吟霉素筛选标签）方案1 .取对数期生长的待感染细胞铺入24孔板，分别设置空白对照孔、对照慢病毒感染孔、目的基因慢病毒感染孔，37C孵箱培养至细胞密度为50%-60%；培养时间在24h之内要达到，否则重新铺3细胞。技巧，在你算好的细胞体积，按70%100%（你的计算细胞浓度和体积）130%铺三种浓度，一般过夜后至少有一组将满足你的要求，省时、省力。2 .取对照慢病毒和目的基因慢病毒，置于冰盒融化，用含10%胎牛血清的培养液+（24孔板每孔约500l）稀释病毒原液成所需浓度（最佳MOI值，因细胞而异），同时加入Polybrene5gml（增加病毒感染效率），轻轻混匀后，分别加入对照慢病毒感染孔、目的基因慢病毒感染孔，空白对照孔只加入含10%胎牛血清的培养液。3 .轻轻混匀后，37细胞培养箱培养1216小时，使病毒感染细胞；4 .移除含病毒的培养液，更换含10%胎牛血清的培养液+青链霉素，继续培养48-72小时至细胞密度为90%左右；5 .不带EDTA的胰酶消化细胞下来以后，直接加温浴过的10%胎牛血清的培养液+青链霉素至24孔板中，连同胰酶一起转移到6孔板，根据细胞类型，贴壁时间不一样，经过3-10h不等，细胞贴壁后移去带胰酶的培养基，加10%胎牛血清的培养液+青链霉素，培养48-72h后。如果你的慢病毒是带有嚓吟霉素筛选标志，执行以下方案培养分别在空白对照孔、对照慢病毒感染孔、目的基因慢病毒感染孔加入合适浓度的噪吟霉素（IUg-2ugml终浓度）筛选710天后（视情况换液或传代），可见空白对照孔的细胞均已死亡；对照慢病毒感染孔和目的基因慢病毒感染孔仍有一定比例的细胞存活，这些存活的细胞即为稳定感染株。用含lgml喋口令霉素（维持筛选压力）的培养液扩增稳定感染株细胞，冻存或用于后续研究。附：喋吟霉素筛选浓度的获得1、取对数生长期的待感染细胞铺入96孔板，设置复孔；2、用含10%胎牛血清的培养液稀释喋吟霉素成不同浓度，如lgmK1.5gmk2gml2.5gml>3gml;3、将含不同浓度喋吟霉素的培养液，加入96孔板；4、37细胞培养箱培养57天后，视情况换液；5、观察96孔板中细胞的存活情况，以能杀死孔板中所有细胞的最低喋吟霉素浓度为最终筛选浓度。如果你的慢病毒是带有GFP筛选标志，执行以下方案荧光镜下细胞在感染病毒24h-72h后，会变绿，如果GFP阳性细胞3天有5%以上的细胞变绿，从6孔板大规模培养到大概1x107细胞数，拿出一半到免疫教研室分选，一般冻存（严格执行附件中有关细胞冻存的步骤）作为原种。GoodLuck!张永国聂勇战提供，希望大家提出更新意见