保健食品功能检验与评价方法（2023）有助于增强免疫力.docx

保健食品功能检验与评价方法（2023年版）有助于增强免疫力1.1 试验项目1.1.1 体重1.1.2 脏器/体重比值测定：胸腺/体重比值,脾脏/体重比值1.1.3 细胞免疫功能测定：小鼠脾淋巴细胞转化实验，迟发型变态反应实验1.1.4 体液免疫功能测定：抗体生成细胞检测，血清溶血素测定1.1.5 单核一巨噬细胞功能测定：小鼠碳廓清实验，小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验1.1.6 NK细胞活性测定1.2 试验原则1.2.1 所列指标均为必做项目。1.2.2 采用正常或免疫功能低下的模型动物进行实验。1.3 结果判定有助于增强免疫力判定：在细胞免疫功能、体液免疫功能、单核一巨噬细胞功能、NK细胞活性四个方而任两个方面结果阳性，可判定该受试样品具有有助于增强免疫力作用。其中细胞免疫功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定细胞免疫功能测定结果阳性。体液免疫功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性,可判定体液免疫功能测定结果阳性。单核一巨噬细胞功能测定项目中的两个实验结果均为阳性，或任一个实验的两个剂量组结果阳性，可判定单核一巨噬细胞功能结果阳性。NK细胞活性测定实验的一个以上剂量组结果阳性，可判定NK细胞活性结果阳性。有助于增强免疫力检验方法1 .实验动物推荐用近交系小鼠，18-22g,单一性别，每组10-15只。2 .剂量分组及受试样品给予时间实验设三个剂量组和一个阴性对照组，以人体推荐量的10倍为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，必要时设阳性对照组。受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天。免疫模型动物实验时间可适当延长。3 .实验方法3.1 ConA诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验可任选下列方法之一3.1.1 MTT法3.1.1.1 原理当T淋巴细胞受ConA刺激后发生母细胞发生增殖反应，活细胞特别是增殖细胞中的线粒体水解前可将MTT（一种淡黄色的哇氮盐）分解为兰紫色结晶，其光密度值能反映细胞的增殖情况。3.1.1.2 仪器和材料RPMI1640细胞培养液、小牛血清、2-航基乙醇（2-ME）、青霉素、链霉素、刀豆蛋白A（ConA）盐酸、异丙醇、MTT、Hank's液、PBS缓冲液（pH7.2-7.4）纱布或200目筛网、24孔培养板，96孔培养板（平底）手术器械、二氧化碳培养箱、酶标仪、721分光光度计、超净工作台、高压灭菌器、无菌滤器。3.1.1.3 实验步骤3.1.1.11 试剂配制完全培养液RPMU640培养液过滤除菌，用前加入10%小牛血清，1%谷氮酰胺（20OmmOI/L）青霉素（100UmL）邮素（100gL）及5X10SmOIzL的2硫基乙醇，用无菌的ImolZL的HCl或Inlol/L的NaC）H调PH至7.07.2,即完全培养液。ConA液用双蒸水配制成100gmL的溶液，过滤除菌，在低温冰箱（-20）保存。无菌Hank's液用前以3.5%的无菌NaHCO3调PH至7.27.4。MTT液将5mgMTT溶于ImLPH7.2的PBS中，现配现用。酸性异丙醇溶液96mL异丙醇中加入4mLImoVL的HCl,临用前配制。3.1.13.2 脾细胞悬液制备无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank's液平皿中，用保子轻轻将脾磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过漉，或用4层纱布将脾磨碎，用Hank's液洗2次，每次离心IOmin（100Or佃in）然后将细胞悬浮于ImL的完全培养液中，用台的兰染色计数活细胞数（应在95%以上）调整细胞浓度为3X106个mL°3.1.13.3 3淋巴细胞增殖反应将每一份脾细胞悬液分两孑血入24孑阴养板中，每孔ImL,一孑血75LCOnA液（相当于75gmL）另一孔作为对照，置5%CO2,37oCCO2孵箱中培养72ho培养结束前4h,每孔轻轻吸去上清液0.7mL,加入0.7mL不含小牛血清的RPMlI640培养液，同时加入MTT（5mgmL）50L孔，继续培养4h。培养结束后，每孔加入ImL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔作3个平行孔，用酶标仪，以57Onm波长测定光密度值。也可将溶解液直接移入2mL比色杯中，721分光光度计上在波长570nm测定OD值。3.1.1.4 数据处理及结果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值Foq5,结论：各组均数间差异无显著性；F值2Foq5,PW005,用多个实验组和一个对照组间为数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。用加ConA孔的光密度值减去不加ConA孔的光密度值代表淋巴细胞的增殖能力，受试样品组的光密度差值显著高于对照组的光密度差值，可判定该项实验结果阳性。3.1.1.5 注意事项本实验中ConA的浓度很重要，过低不能刺激足帔的细胞增殖，过高会抑制细胞增殖，不同批号的ConA在实验前要进行预试，以找到最佳浓度。3.1.2同位素掺入法1.1.1.1 理T淋巴细胞在有丝分裂原PHA、COnA等的刺激下，产生增殖反应，DNA和RNA合成明显增加，如在培养液中加入3H胸腺嗑咤核甘(5H-TdR)则可被转化中的细胞摄入。测定标记淋巴细胞的放射强度可反映淋巴细胞增殖的程度。1.1.1.2 仪器和材料RPMI1640细胞培养液、小牛血清、2.疏基乙醇(2MEX青毒素、链霉素、刀豆蛋白A(ConAlHank's液PBS缓冲液pH727.4YH-TdRM烁液2,5二苯基驰坐(PPo)0.5gJ,4双“0.25g、5苯基恶哇基).笨PoPOP)二甲苯500mL混匀200目筛网，96孔培养板（平底），手术器械、二氧化碳培养箱、超净工作台、液体闪烁仪、多头细胞取集器、49型玻璃纤维滤纸。1.1.1.3 实验步骤1.1.1.3.1 脾细胞悬液制备无菌取脾，置于盛有适量无菌Hankk液的小平皿中，用银子轻轻将脾撕碎，制成单细胞悬液。经200目筛网过滤，用Hankt液洗3次，每次离心IOmin（100OrZmin）然后将细胞悬浮于2mL的完全培养液中，用台酚兰染色计数活细胞数（应在95%以上）最后用RPMI1640完全培养液将细胞数调成5X1（）6个nL.1.1.1.3.2 淋巴细胞增殖反应将脾细胞悬液力11J96孑L培养板中，200L孑L,所份三H胞悬液分装6个孑L,3孑UJrIConA（5gmL）另3个孑L不力口COnA作为对照。置5%Co2,37C培养72h,培养结束前6h,每孔加入3H-TdR20L,使其终浓度为（3.718.5）X104BqmL。用多头细胞收集器将细胞取集于玻璃纤维滤纸上。滤纸片充分干燥后置测量瓶中,加入7mL闪烁液，用液闪仪测定每分钟脉冲数（CPm）1.1.1.4 数据处理及结果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算产值，F值尸03,结论：各组均数间差异无显著性；F值2FoO5,PW005,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。以每分钟脉冲数（CPm）表示增殖程度，用刺激指数（SI）来表示SI=实验孔cp对照孔cpm受试样品组的SI值显著高于对照组的Sl值，即可判定该项实验结果阳性。3.2迟发型变态反应（DTH）可任选下列方法之一3.2.1 二硝基氟苯诱导小配DTH（耳肿胀法）3.2.1.1 原理二硝基氟苯（DNFB）稀释液可与腹壁皮肤蛋白结合成完全抗原，由此刺激T淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞。47天后再将其涂抹于耳部进行抗原攻击，使局部肿胀，一般在抗原攻击后2448h达高峰，其肿胀程度可以反应映迟发型变态反应程度。3.2.1.2 材料DNFB,丙的、麻油、碳化领、打孔器。3.2.1.3 实验步骤12.1.3.1试剂配制DNFB溶液DNFB溶液应新鳏涮，称取DNFB50mg,置清洁干燥小瓶中，将预先配好的5mL丙酮麻油溶液（丙酮：麻油=1：I）倒入小瓶，盖好瓶塞并用胶布密封。混匀后，用250L注射器通过瓶盖取用。1.1.1.1.2 致敏每鼠腹部皮肤用硫化铁脱毛或剃毛，范围约女mX女m,用DNFB溶液50L均匀涂抹致敏。1.1.1.1.3 DTH的产生与测定5天后，用DNFB溶液10L均匀涂抹于小鼠右耳（两面）进行攻击。攻击后24h颈椎脱臼处死小鼠，剪下左右耳壳。用打孔器取下直径8mm的耳片，称重。3.2.1.4 数据处理与结果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值Ros,结论：各组均数间差异无显著性；F值2FoO5,P005,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比较方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。用左右耳重量之差表示DTH的程度。受试样品组的重量差值显著高于与对照组的重量差值，可判定该项实验结果阳性。3.2.1.5 注意事项操作时应避免DNFB与皮肤接触。3.2.2绵羊红细胞（SRBC）诱导小鼠DTH（足跖增厚法）3.2.2.1 原理SRBC可刺激T淋巴细胞增殖成致敏淋巴细胞，4天后，当再以SRBC攻击时，攻击部位出现肿胀，其肿胀程度可反映迟发型变态反应程度。322.2 材料游标卡尺（精密度0.02mm）SRBC、微量注射器（50L1322.3 实验步骤1.1 .2.3.1致敏小鼠用2%（vv）SRBC腹腔或静脉注射免疫，每只鼠注射0.2mL（约1XIO8个SRBC）1.2 .3.2DTH的产生与测定免疫后4天测量左后足跖部厚度,然后在测量部位皮下注射20%（vv）SRBC,每只鼠20L（约IX108个SRBC）注射后于24h测量左后足跖部厚度，同一部位测量三次，取平均值。1.3 .2.4数据处理和结果判定一般采用方差分析，但需按方差分析的程序先进行方差齐性检验，方差齐，计算F值，F值同.05,结论：各组均数间差异无显著性；F值FoO5,PW005,用多个实验组和一个对照组间均数的两两比莪方法进行统计；对非正态或方差不齐的数据进行适当的变量转换，待满足正态或方差齐要求后，用转换后的数据进行统计；若变量转换后仍未达到正态或方差齐的目的，改用秩和检验进行统计。以攻击前后足跖厚度的差值来表示DTH的程度。受试样品组的差值显著高于对照组的差值，可判定该项实验结果阳性。322.5 注意事项测量足跖厚度时，最好由专人来进行。卡尺紧贴足跖部，但不要加压，否则会影响测量结果。攻击时所用的SRBC要新鲜（4保存期不超过1周）322.6 生成细胞检测（Jenle改良玻片法）322.6.1经过绵羊红细胞（SRBC）免疫的小鼠脾细胞悬液与一定量的SRBC混合，在补体参与下，使分泌抗体的脾细胞周围的SRBC溶解，形成肉眼可见的空斑。溶血空斑数可反映抗体生成细胞数。322.6.2 和材料二氧化碳培养箱、恒温水浴、离心机、手术器械、玻片架、200目筛网、SRBC,辛琳（豚鼠血清）Hankk液、RPMI1640培养液、SA缓冲液、琼脂糖。333实验步骤3.3.3