线粒体转氢酶-2TH-2试剂盒说明书.docx

线粒体转氢酶-2(TH-2)试剂盒说明书微法100*96样注意I正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定刑定意义，TH位于线粒体的内膜上，又称为线粒体复合体六，催化NADH+NADP，和NAD+NADPH相互转化，调节线粒体NAD（三）和NADP（三）平衡把逆向反应称为TH-2,催化NADPH和NAD生成NADP+f11NADH-测定原理，NADH和NADPH均在340nm有特征吸收,因此TH催化的转氢反应不能导致340nm吸光度发生变化.用人工合成底物3-乙酰哦咤腺嗦吟二核甘酸(APAD+)替代NAD+,TH-2催化APAD+还原生成APADH,APADH在375nm有特征光吸收，测定375nm光吸收的增加速率，来计算TH-2活性。需自备的仪器和用品：可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、ImL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馋水-试剂的组成和配制：试剂一：液体lmL×l瓶，-20IC保存；试剂二:液体50mL*l瓶，-20匕保存；试剂三:液体18mL×l瓶，41C保存；试剂四：粉剂x1支，一20t保存；试剂五：粉剂Xl支，-2Ot保存：样本的前处理：组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：准确称取0.1g组织或收集500万细胞，加入ImL试剂一，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。将匀浆600g,41C离心5min.弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g,4寸离心10min.上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的TH-2(此步可选做).步骤中的沉淀即为线粒体，加入500UL试剂二，超声波破碎(冰浴，功率20%或200W,超声3s,问隔10秒，重复30次)，用于TH-2活性测定.JM定步事：1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至375nm,蒸憎水调零。2、样本测定(I)工作液的配制：临用前将试剂四、五转移到试剂三中混合溶解，置于37C(哺乳动物)或25P(其它物种)水浴5min；用不完的试剂分装后-20保存，禁止反复冻融。(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入20UL样本和180HL工作液，混匀，立即记录375nm处初始吸光值Al和IOmin后的吸光值A2,计算AA=A2-A1.TH-2活性计算：a.用微石英比色JILiM定的计算公式如下<1)按样本蛋白浓度计算单位的定义：每mg组织蛋白每分钟产生1nmolAPADH定义为一个酶活性单位.TH-2活性(nmol/min/mgprot)=AA><V反总+(×d)xlO°÷(V样xCpr)÷T=149><AA÷Cpr(2)按样本鲜重计算单位的定义：每g组织每分钟产生1nmolAPADH定义为一个酶活性单位。TH-2活性(nmol/min/g鲜重)=AA*V反总÷(×d)x10,*WXV样÷V样总)÷T=74.5*AA÷W<3)按细菌或细胞密度计算单位的定义：每I万个细菌或细胞每分钟产生1nmolAPADH定义为一个酶活性单位。TH-2活性(nmol/min104cell)=AA*V反总十(×d)x09÷(500xV样÷V样总)÷T=0.149><AAV反总:反应体系总体积，2×104Lse：APADH摩尔消光系数，6.7×103Lmolcmsd>比色皿光径，1cm：V样：加入样本体积，0.02mL；V样总：加入提取液体积，0.5mL；T：反应时间，10min；Cpr：样本蛋白质浓度，mgmLiW：样本质量，g；500：细菌或细胞总数.500万。b.用96孔板测定的计算公式如下<1)按样本蛋白浓度计算单位的定义：每mg组织蛋白每分钟产生InmolAPADH定义为一个酶活性单位。TH-2活性(nmol/min/mgproi)=AA><V反总÷(×d)×10,÷<Vff×Cpr)÷T=298×A÷Cpr(2)按样本鲜重计算单位的定义：每g组织每分钟产生1nmolAPADH定义为一个酶活性单位.TH-2活性(nmol/min/g鲜重)=AA*V反总十(×d)x109÷(WxV样÷V样总)÷T=149><AA+W<3)按细菌或细胞密度计算单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟产生1nmolAPADH定义为一个酶活性单位.TH-2活性(nmolmin104cell)=AAV反总-(/d)KIOl*÷<5Q0xV样+V样总)=0.298*AAV反总：反应体系总体积，2x104L；e：APADH摩尔消光系数，6.7×1O,L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5cm:V样：加入样本体积，0.02mL：V样总：加入提取液体积，0.5mL：T：反应时间，1Omin；Cpr：样本蛋白励浓度，mg/niL：W：样本质量，g：500：细菌或细胞总数，500万。