蛋白质的离子交换层析技术研究进展.ppt

蛋白质离子交换层析技术蛋白质离子交换层析技术 蛋白质离子交换层析技术蛋白质离子交换层析技术1234561.离子交换层析的原理 以离子交换剂为固定相，依据流动相中的以离子交换剂为固定相，依据流动相中的组分离子组分离子与交换与交换剂上的剂上的平衡离子平衡离子进行可逆交换时的进行可逆交换时的结合力大小结合力大小的差别而进的差别而进行分离的一种层析方法。行分离的一种层析方法。蛋白质（以蛋白质（以静电引力静电引力为主）的离子交换层析为主）的离子交换层析两性分子，不同pH，所带电荷种类和数目不同所带电荷种类和数目不同高级结构，大分子，大分子，多位点吸附除静电力还有氢键、疏水作用、范德华力等待分离的目标分子和杂质一起进入平衡后的离子交换剂，目标分子和待分离的目标分子和杂质一起进入平衡后的离子交换剂，目标分子和杂质因带电量不同，与离子交换剂有不同的结合程度，通过逐渐增加杂质因带电量不同，与离子交换剂有不同的结合程度，通过逐渐增加盐离子浓度，将目标分子和杂质分别洗脱下来，从而实现目标分子和盐离子浓度，将目标分子和杂质分别洗脱下来，从而实现目标分子和杂质的分离。杂质的分离。2.12.22.32.1离子交换剂的基本结构基质应具备的特点：基质应具备的特点：机械稳定性强机械稳定性强，适合高流速，适合高流速 化学稳定性好化学稳定性好，在很宽的，在很宽的pH范围内保持稳定，能耐去污范围内保持稳定，能耐去污剂、有机溶剂。剂、有机溶剂。球形，颗粒均匀。球形，颗粒均匀。亲水性亲水性。高交换容量高交换容量，要有较大的孔径，要有较大的孔径。平衡离子平衡离子2.2离子交换剂的指标：离子交换剂能结合溶液中可交换离子的能力，离子交换剂能结合溶液中可交换离子的能力，通常用有效交换容量和实际交换容量来表示。通常用有效交换容量和实际交换容量来表示。膨胀度：膨胀度：干态的交换剂吸水后造成体积膨胀的程度。干态的交换剂吸水后造成体积膨胀的程度。粒径：粒径：一一般都在般都在3-300m 交联度及网孔结构：交联度及网孔结构：交交联度越高，机械强度越好，耐压性联度越高，机械强度越好，耐压性能越好。能越好。电荷密度：电荷密度：基质颗粒单位表面积的取代基数量。对于蛋白基质颗粒单位表面积的取代基数量。对于蛋白质，介质的电荷密度往往较低。以免结合过牢，难以洗脱质，介质的电荷密度往往较低。以免结合过牢，难以洗脱且易变性。且易变性。粒径粒径分辨率分辨率，分离效果，分离效果，但流速，但流速实际交换容量实际交换容量有效交换容量有效交换容量2.3离子交换剂的分类 根据活性基团的酸碱性质和解离性质：根据活性基团的酸碱性质和解离性质：酸碱性质：酸碱性质：解离性质：解离性质：阳离子交换剂：阳离子交换剂：活性基团为酸性，结合阳离子活性基团为酸性，结合阳离子阴离子交换剂：阴离子交换剂：活性基团为碱性，结合阴离子活性基团为碱性，结合阴离子强离子交换剂：强离子交换剂：活性基团为强酸强碱活性基团为强酸强碱弱离子交换剂：弱离子交换剂：活性基团为弱酸弱碱活性基团为弱酸弱碱类型类型名称名称英文符号英文符号阴离子阴离子强碱强碱季铵基季铵基Q Q季铵基乙基季铵基乙基QAEQAE弱碱弱碱二乙氨基乙基二乙氨基乙基DEAEDEAE阳离子阳离子强酸强酸磺丙基磺丙基SPSP磺乙基磺乙基SESE弱酸弱酸羧甲基羧甲基CMCM2.3离子交换剂的分类由于树脂的孔径过小，且电荷密度过高，疏水性过强由于树脂的孔径过小，且电荷密度过高，疏水性过强使得大分子结合过牢而不易洗脱，同时，会造成变性。使得大分子结合过牢而不易洗脱，同时，会造成变性。通常用于蛋白质的离子交换剂多为纤维素等多糖类。通常用于蛋白质的离子交换剂多为纤维素等多糖类。n纤维素纤维素n葡聚糖葡聚糖n琼脂糖琼脂糖n高效型高效型n非孔型非孔型n聚乙烯醇型聚乙烯醇型2.3离子交换剂的分类 开放性长链，较大的表面积，吸附容量最大开放性长链，较大的表面积，吸附容量最大 离子基团少，排列稀疏，与蛋白质结合不太牢固，易于洗离子基团少，排列稀疏，与蛋白质结合不太牢固，易于洗脱脱 良好的稳定性，洗脱剂的选择范围广良好的稳定性，洗脱剂的选择范围广2.3离子交换剂的分类 目前使用交联葡聚糖主要来自目前使用交联葡聚糖主要来自Pharmacia公司，主要有公司，主要有4种类型，都是以种类型，都是以SephadexG为骨架为骨架 商品名分别为商品名分别为SephadexA-25 SephadexC-25 SephadexA-50 SephadexC-50SephadexA-25以以SephadexG，即交联，即交联葡聚糖为骨架葡聚糖为骨架A:阴离子阴离子C:阳离子阳离子凝胶吸水值的凝胶吸水值的10倍倍2525为每克凝胶膨胀时吸水为每克凝胶膨胀时吸水2.52.5克克2.3离子交换剂的分类123TECHNOSepharose系列系列SepharoseCL-6BBio-Gel系列系列34m90m200m90m大孔珠状大孔珠状颗粒状颗粒状Q型型SP型型SepharoseHP弱型（弱型（DEAE，ANXCM）强型（强型（Q，SP）SepharoseFFQ型型SP型型SepharoseBBDE型型CM型型2.3离子交换剂的分类 高效型：高效型：SOURCE系列、系列、MonoBeads系列系列刚性的骨架结构：高硬度、高流速刚性的骨架结构：高硬度、高流速亲水表面：低特异性吸附亲水表面：低特异性吸附 非孔非孔型型：MiniBeads系列系列所有的结合都发生在颗粒表面所有的结合都发生在颗粒表面液膜扩散小，快速；颗粒小，分辨率高液膜扩散小，快速；颗粒小，分辨率高 聚乙烯醇型：聚乙烯醇型：Toyopearl系列系列多孔型三维网状结构，富含羟基，高度亲水多孔型三维网状结构，富含羟基，高度亲水无孔型无孔型有孔型有孔型无孔型无孔型微孔型微孔型大孔型大孔型2.3离子交换剂的分类 高效型：高效型：SOURCE系列、系列、MonoBeads系列系列刚性的骨架结构：高硬度、高流速刚性的骨架结构：高硬度、高流速亲水表面：低特异性吸附亲水表面：低特异性吸附 非孔非孔型型：MiniBeads系列系列所有的结合都发生在颗粒表面所有的结合都发生在颗粒表面液膜扩散小，快速；颗粒小，分辨率高液膜扩散小，快速；颗粒小，分辨率高 聚乙烯醇型：聚乙烯醇型：Toyopearl系列系列多孔型三维网状结构，富含羟基，高度亲水多孔型三维网状结构，富含羟基，高度亲水3.13.23.33.1离子交换剂 按规模：按规模：分析型分离，一般用柱色谱；大规模工业化分离，分析型分离，一般用柱色谱；大规模工业化分离，有柱色谱、膨胀床吸附、分批分离等多种模式有柱色谱、膨胀床吸附、分批分离等多种模式 按目的：按目的：在预处理和初分级阶段，目的是提取和浓缩目标在预处理和初分级阶段，目的是提取和浓缩目标分子；在细分级和最后的精制阶段，目的是去除杂质，获分子；在细分级和最后的精制阶段，目的是去除杂质，获得单一组分。得单一组分。目标分子的大小：目标分子的大小：选择合适孔径的基质选择合适孔径的基质 目标分子的电荷及目标分子的电荷及pH稳定性：稳定性：在起始缓冲液中，目标分子和介质的功能基团带相反的电在起始缓冲液中，目标分子和介质的功能基团带相反的电荷，以利于目标分子结合在色谱柱上，荷，以利于目标分子结合在色谱柱上，起始相洗脱，杂质和介质的功能基团带相反的电荷，从而起始相洗脱，杂质和介质的功能基团带相反的电荷，从而吸附在色谱柱上。这时，收集流穿峰即可。吸附在色谱柱上。这时，收集流穿峰即可。3.2色谱柱 通常用高径比较小的柱子通常用高径比较小的柱子离子交换柱的高度一般在离子交换柱的高度一般在5-20cm确定基本参数后，可通过直径确定基本参数后，可通过直径扩大分扩大分离规模。离规模。3.3缓冲液 缓冲离子：缓冲离子：与功能基团带相同的电荷与功能基团带相同的电荷 pH：蛋白质的蛋白质的pI缓冲液的缓冲液的pH缓冲液的种类缓冲液的种类 离子强度：离子强度：离子强度离子强度利于洗脱，不利于吸附利于洗脱，不利于吸附4.离子交换的操作方法离子交换的操作方法4.14.24.34.44.54.1预处理 预装柱：预装柱：SOURCE、MonoBeads、MiniBeads系列系列 无需处理，直接使用。无需处理，直接使用。湿胶湿胶：无需预处理，使用前倾去上清，添加起始缓冲液，无需预处理，使用前倾去上清，添加起始缓冲液，搅匀后装柱即可搅匀后装柱即可 干胶干胶：需溶胀。通常室温需溶胀。通常室温1-2d，沸水浴，沸水浴2h。Sephadex系列：系列：不能用蒸馏水，避免强烈搅拌。不能用蒸馏水，避免强烈搅拌。纤维素系列：纤维素系列：制造制造的过程中，产生一些细颗粒，将纤维素在水中搅的过程中，产生一些细颗粒，将纤维素在水中搅 匀后，自然沉降，匀后，自然沉降，倾去上清漂浮物倾去上清漂浮物，反复数次即可。，反复数次即可。制造完后，未经处理，含很多杂质成分，需洗涤，用制造完后，未经处理，含很多杂质成分，需洗涤，用 0.5mol/L的的NaOH和和0.5mol/L的的HCl进行进行“碱碱-酸酸-碱碱”反反复浸泡复浸泡，每次半小时，期间用蒸馏水洗至中性。，每次半小时，期间用蒸馏水洗至中性。4.2装柱、平衡 装柱：装柱：排空柱底部的死体积，轻轻搅匀交换剂与缓冲液的排空柱底部的死体积，轻轻搅匀交换剂与缓冲液的混合液，玻棒引流，使液体沿柱壁流下，尽可能一次性注混合液，玻棒引流，使液体沿柱壁流下，尽可能一次性注入，让介质自然沉降。入，让介质自然沉降。保持柱的垂直状态，防止产生气泡、防止分层保持柱的垂直状态，防止产生气泡、防止分层。平衡：平衡：用起始缓冲液平衡，检测下端流出液与起始缓冲液用起始缓冲液平衡，检测下端流出液与起始缓冲液在在pH、电导、离子强度方面是否达一致。、电导、离子强度方面是否达一致。对于弱离子交换剂，本身具有一定的缓冲能力，平衡时间对于弱离子交换剂，本身具有一定的缓冲能力，平衡时间很长。通常用酸或碱将很长。通常用酸或碱将pH调至起始调至起始pH；或用与起始缓冲；或用与起始缓冲液液pH相同，但离子强度更大的缓冲液，加快相同，但离子强度更大的缓冲液，加快pH平衡，最平衡，最后用起始缓冲液平衡。后用起始缓冲液平衡。4.3上样、洗涤 上样上样 加样量加样量：目的物含量为有效交换容量的：目的物含量为有效交换容量的10-20%。方法：方法：预装柱，通过恒流泵加样。预装柱，通过恒流泵加样。自装柱，采用排干法：自装柱，采用排干法：加样时，不能搅动床面，要保持床面的完整。加样时，不能搅动床面，要保持床面的完整。洗涤洗涤 加样完后，用起始缓冲液填满柱上端，拧紧上口，用恒流加样完后，用起始缓冲液填满柱上端，拧紧上口，用恒流泵泵入起始缓冲液泵泵入起始缓冲液4.4洗脱 缓冲离子：缓冲离子：与功能基团带相同的电荷与功能基团带相同的电荷 pH：蛋白质的蛋白质的pI缓冲液的缓冲液的pH缓冲液的种类缓冲液的种类 离子强度离子强度：离子强度离子强度利于洗脱，不利于吸附利于洗脱，不利于吸附4.4洗脱-般采用分部洗脱和连续洗脱。般采用分部洗脱和连续洗脱。分部洗脱：分部洗脱：几种不同洗脱能力的缓冲液相继进行洗脱几种不同洗脱能力的缓冲液相继进行洗脱优点：设备和操作简单；洗脱迅速；洗脱液体积小优点：设备和操作简单；洗脱迅速；洗脱液体积小缺点：性质相近的组分不易分开；同一组分出现多个峰缺点：性质相近的组分不易分开；同一组分出现多个峰 连续洗脱连续洗脱：逐渐增强洗脱缓冲液的洗脱能力，分辨率逐渐增强洗脱缓冲液的洗脱能力，分辨率4.5色谱柱的再生与清洗 一般，高浓度盐（通常是一般，高浓度盐（通常是2M的的NaCl）溶液清洗）溶液清洗 对于一些结合较牢固的物质，如变性的蛋白，沉淀而聚集对于一些结合较牢固的物质，如变性的蛋白，沉淀而聚集的蛋白，疏水性蛋白或脂蛋白等一些胶状物，用酸和碱洗的蛋白，疏水性蛋白或脂蛋白等一些胶状物，用酸和碱洗脱脱 疏水性更强的蛋白、脂蛋白以及脂类，用非离子去污剂或疏水性更强的蛋白、脂蛋白以及脂类，用非离子去污剂或有机溶剂（有机溶剂（70%的乙醇或的乙醇或30%异丙