第3章DNA结合蛋白.ppt
w第一节 DNA结合蛋白w第二节 RNA的转录w第三节 启动子w第四节 终止与抗终止w第五节 原核生物和真核生物mRNA的特征比较w第六节 内含子的剪接、编辑及化学修饰第三章 生物信息的传递 从DNA到RNA第三章 生物信息的传递 从DNA到RNA第一节第一节 DNA结合蛋白结合蛋白200bpDNA结合蛋白结合蛋白基因基因DNA结合蛋白的结合位点是一个基因的上游序列一、研究一、研究DNA结合蛋白的方法结合蛋白的方法凝胶阻滞实验凝胶阻滞实验(gel retardation)修饰保护测试修饰保护测试(modification assay)修饰干扰实验修饰干扰实验（modification interference）二、二、DNA结合蛋白质的纯化结合蛋白质的纯化 亲和层析法亲和层析法杂交探针法杂交探针法X-射线衍射晶体分析射线衍射晶体分析(X-ray diffraction pattern)标记标记DNA片段片段标记标记DNA片段与片段与蛋白质混合物蛋白质混合物C1C2C3C4C5C6C1C2C3C4C5C6游离游离DNADNA凝胶阻滞电泳一、研究一、研究DNA结合蛋白的方法结合蛋白的方法修饰保护测试修饰保护测试(modification assay)原理：如果一个原理：如果一个DNA分子携带一个结合蛋白，那么该分子携带一个结合蛋白，那么该部分核苷酸序列会被保护而不能被修饰。有两种修饰方法部分核苷酸序列会被保护而不能被修饰。有两种修饰方法：1.用核酸酶处理用核酸酶处理，可以裂解除被结合蛋白保护之外的所有，可以裂解除被结合蛋白保护之外的所有磷酸二酯键，通过磷酸二酯键，通过足迹法足迹法进行检测。进行检测。；2.暴露于甲基化试剂暴露于甲基化试剂，例如可将甲基加到核苷酸，例如可将甲基加到核苷酸G上形成上形成二甲基硫酸盐，而被结合蛋白所保护的二甲基硫酸盐，而被结合蛋白所保护的G则不能被甲基化。则不能被甲基化。DNase I 印迹试验(DNase I foot printing)修饰保护测试修饰保护测试(modification assay)一、研究一、研究DNA结合蛋白的方法结合蛋白的方法修饰干扰实验修饰干扰实验（modification interference）原理：如果一个对蛋白质结合起关键作用的核苷原理：如果一个对蛋白质结合起关键作用的核苷酸被改变，例如加一个甲基，则可能会抑制蛋白的结酸被改变，例如加一个甲基，则可能会抑制蛋白的结合。修饰剂合。修饰剂二甲基硫酸盐（二甲基硫酸盐（DMS）。）。修饰保护修饰保护不应与不应与修饰干扰修饰干扰相混淆，后者是蛋白质相混淆，后者是蛋白质结合研究中的一种更敏感的技术。结合研究中的一种更敏感的技术。用DMS处理靶DNA，使平均每条链上只有一个G被甲基化。将局部甲基化的DNA与含DNA结合蛋白的细胞提取物共温育后进行凝胶滞缓试验。分离各种DNA条带，并用六氢吡啶切割甲基化的残基。如果因某个G残基的甲基化作用而阻止了蛋白质与DNA的结合，那么，六氢吡啶对这个甲基化G残基的切割作用，就只能在没有蛋白质结合的DNA中观察到。与蛋白质结合与蛋白质结合与蛋白质结合与蛋白质结合不能与蛋白质结合不能与蛋白质结合与蛋白质结合的与蛋白质结合的DNA带含有带含有和和两种类型的两种类型的DNADNA片段片段不能与蛋白质结合的不能与蛋白质结合的DNA带带含有全部含有全部3种种类型的类型的DNADNA片段片段切出所有结合切出所有结合与不结合蛋白与不结合蛋白质的质的DNA带带,并并用六氢吡啶切用六氢吡啶切割甲基化的割甲基化的G残基残基缺失的缺失的DNA带表明带表明相应相应G残基的重要残基的重要意义意义,它得到结合蛋它得到结合蛋白质的保护白质的保护三、三、DNA和和DNA结合蛋白的相互作用结合蛋白的相互作用 不同的不同的DNA结合蛋白有广泛的活性，而且调节基结合蛋白有广泛的活性，而且调节基因组表达仅是这类蛋白的功能之一。多数参与基因组表因组表达仅是这类蛋白的功能之一。多数参与基因组表达的蛋白质识别特定的达的蛋白质识别特定的DNA序列，序列，并主要结合在这些并主要结合在这些靶位点上。尽管具有多样性，但所有的靶位点上。尽管具有多样性，但所有的DNA结合蛋白结合蛋白至少都一个共同点，即它们与至少都一个共同点，即它们与DNA结合，蛋白质与结合，蛋白质与DNA的结合似乎只有有限的几种方式。的结合似乎只有有限的几种方式。三、三、DNA和和DNA结合蛋白的相互作用结合蛋白的相互作用1.参与蛋白质相互作用的参与蛋白质相互作用的DNA核苷酸序列的直接读取核苷酸序列的直接读取TA大沟大沟小沟小沟vdWvdWaaaaada：氢键受体d：氢键供体vdW：范德华力B型双螺旋A-T碱基对的识别核苷酸序列对螺旋结构的间接影响核苷酸序列对螺旋结构的间接影响a.DNA双螺旋结构的多态性双螺旋结构的多态性b.DNA弯曲（弯曲（DNA bending）ABZMiMaMaMiMiMa三、三、DNA和和DNA结合蛋白的相互作用结合蛋白的相互作用大沟宽小沟窄小沟窄大沟不存在小沟窄而深大沟变深小沟宽浅ABZHandednessBase Inclination三、三、DNA和和DNA结合蛋白的相互作用结合蛋白的相互作用2.参与相互作用的蛋白质参与相互作用的蛋白质 为了以特异的方式结合，一个蛋白质必须以能识为了以特异的方式结合，一个蛋白质必须以能识别核苷酸序列的方式与双螺旋接触。这个家族可以根别核苷酸序列的方式与双螺旋接触。这个家族可以根据与据与DNA分子相互作用的蛋白质片段的结构而分为几分子相互作用的蛋白质片段的结构而分为几个不同的群体。很多蛋白质中都有这些个不同的群体。很多蛋白质中都有这些DNA结合基序结合基序（DNA-binding motif），这些蛋白常来自差别很大的），这些蛋白常来自差别很大的生物，并且至少其中一些很可能进化了一次以上。与生物，并且至少其中一些很可能进化了一次以上。与DNA结合的转录因子大多以二聚体形式起作用。结合的转录因子大多以二聚体形式起作用。几种几种DNA结合基序结合基序基序基序具有这种基序的蛋白具有这种基序的蛋白螺旋转角螺旋家族螺旋转角螺旋家族标准的螺旋转角螺旋同源异形结构域高迁移率组结构域大肠杆菌乳糖阻遏物，色氨酸阻遏物果蝇触角足蛋白哺乳动物的性别决定蛋白SRY锌指家族锌指家族Cys2His2锌指多半胱氨酸锌指碱性结构域真核生物转录因子TF A 高等真核生物的类固醇受体家族酵母GCN4转录因子非特异性非特异性DNA结合基序结合基序组蛋白折叠聚合酶裂隙真核生物组蛋白DNA和RNA聚合酶螺旋转角螺旋（helixturnhelix，HTH）基序 锌指(zinc finger)碱性亮氨酸拉链(basic leucine zipper,bZIP)
