高铁血红蛋白还原试验比色法.docx

高铁血红蛋白还原试验比色法1 .实验原理有足量的NADPH存在下，反应液中的高铁血红蛋白能被高铁血红蛋白还原酶（即细胞色素b”亦称黄酶素）还原成（亚铁）血红蛋白。在体外，这一还原过程还需要递氢体亚甲基蓝的参与。当红细胞内葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（GJD）含量正常时，由磷酸戊糖代谢途径生成的NADPH的数量足以完成上述还原反应。当红细胞内G6PD含量不足或缺乏时，高铁血红蛋白还原速度减慢，甚至不能还原。高铁血红蛋白呈褐色，在波长635nm处有吸收峰，可用分光光度计加以测定。2 .标本：2. 1病人准备：无特殊。2.2类型：枸檄酸钠抗凝血（葡萄糖20mg）。2 .3标本采集：在试管中加入葡萄糖20mg,109mmolL枸椽酸钠溶液0.2ml,静脉血1.8ml,混匀。3 .标本存放标本不宜存放。4 .标本运输常温条件下运输。5 .标本拒收标准抗凝剂不符合的、细菌污染的标本。6 .实验材料6.1.0.18molL亚硝酸钠和0.28molL葡萄糖混合溶液亚硝酸钠1.25g+葡萄糖5.Og+蒸储水加至100ml；贮存于棕色瓶中，放4冰箱，可保存1个月o6.20.4mmolL亚甲基蓝溶液亚甲基蓝（含3个结晶水）0.15g+蒸储水加至100ml；先将亚甲基蓝放入乳钵中，加蒸储水少量研磨，待溶解后移到100ml容量瓶中，再加蒸储水至IoOnII混匀过滤，此液可贮存3个月。6.1.30.02molL磷酸盐缓冲液（pH7.4）磷酸氢二钠229.5mg+磷酸二氢钾52.2mg+蒸储水加至100nlI（或用0.0667molLpH7.4磷酸盐缓冲液稀释3倍。6. 1.4109Imnol/L枸檬酸钠溶液（32gL）.7. 仪器722分光光度计，使用方法见其操作与维护规程.SOP文件。8操作步骤8. 1将标本离心15min取出，调整血细胞与血浆比例为1:1后再混匀。8.2取上述抗凝血1ml,加亚硝酸钠葡萄糖混合溶液和亚甲基蓝溶液各0.05ml,颠倒混合15次，使与氧气充分接触，加塞后放37。C水浴或孵箱中3ho8.3孵育后混匀，取血0.1ml,加pH7.4磷酸盐缓冲液IOm1,混匀，2min后在波长635nm处测定吸光度（设为SA）。8.4空白对照，用未加亚硝酸钠葡萄糖的血液，同样孵育后取0.1ml,加pH7.4磷酸缓冲液10ml,2min后测定吸光度为Bo然后加入亚硝酸钠葡萄糖混合溶液1滴，混匀，5min后再测其吸光度St,此为高铁血红蛋白对照。9.计算：SA-B高铁血红蛋白还原率=1一St-B式中：SA-B.St-B分别为还原后和还原前高铁血红蛋白吸光度；SA-B为还原后剩余高铁血红蛋白的比值。St-B9.检验结果的判断与分析高铁血红蛋白还原率在30%以下时，患者G-6-PD缺陷为纯合子，杂合子则呈中间值，多在74%-31%之间。10参考范围：高铁血红蛋白还原率应超过75%。11临床意义：减低：蚕豆病和伯氨瞳咻型药物溶血性贫血患者由于G-6-PD缺陷（隐性遗传），高铁血红蛋白还原率明显下降，纯合子常在30%以下，杂合子则呈中间值，多在74%-31%之间。12.注意事项：12.1红细胞比值低于30%时，高铁血红蛋白还原率降低，所以须调整红细胞与血浆的比例。12. 2本试验抗凝剂若使用ACD保养液时，ACD保养液与血之比为0.15:1。该抗凝血可保存1周。因草酸盐具有还原性，不宜使用。12.3标本不应有凝血或溶血，以免影响测定结果。12.4测定吸光度时，分光光度计的波长应准确。一般要求St比B大8倍以上。