鸡新城疫血凝和血凝抑制实验.ppt

鸡新城疫的实验室诊断及免疫效果的评价目的目的1、掌握鸡新城疫的临诊要点。、掌握鸡新城疫的临诊要点。2、了解和掌握鸡新城疫的实验室诊断和、了解和掌握鸡新城疫的实验室诊断和免疫监测技术。免疫监测技术。内容内容1、鸡新城疫的临诊要点。、鸡新城疫的临诊要点。2、鸡新城疫的实验室诊断。、鸡新城疫的实验室诊断。NDV的分离及鉴定；的分离及鉴定；NDV毒力的鉴定毒力的鉴定3、鸡新城疫的免疫效果评价、鸡新城疫的免疫效果评价鸡新城疫的免疫监测鸡新城疫的免疫监测 血凝试验(HA)和血凝抑制试验(HI)血凝试验（HA）和血凝抑制试验(HI)HA和HI的原理HA试验：许多病毒表面有血凝素，能与各种动物的红细胞表面受体结 合，而出现红细胞凝集现象，简称为病毒的血凝现象。2.HI试验：病毒的红细胞凝集现象，可以被特异性免疫血清所抑制，称HI试验。一、鸡新城疫的血凝试验(HA)【材料】【材料】新城疫病毒鸡胚接种尿囊液 1份 0.5鸡血球悬液 1管 生理盐水或PBS 1瓶 96孔微量血清盘 1块 微量加样器 1支 一、鸡新城疫的血凝试验(HA)【方法与步骤方法与步骤】（一）制备鸡红细胞悬液：（一）制备鸡红细胞悬液：1.用注射器抽取抗凝剂。2.用上述注射器，采用无菌法抽取健康的未免疫鸡的静脉血。3.混匀，加生理盐水适量，洗涤离心，共离心三次（第一、二次2000转/分5分钟、第三次3000转/分 5分钟）洗去血清及白细胞。取纯红细胞0.6ml，加生理盐水稀释99.4ml，即成1%的鸡红细胞悬液。一、鸡新城疫的血凝试验(HA)（二）加样二）加样1.在在96孔微量反应板上进行，自左至右各孔加孔微量反应板上进行，自左至右各孔加50 L生理盐水。生理盐水。2.于左侧第于左侧第1孔加孔加50 L病毒液，混合均匀后，吸病毒液，混合均匀后，吸50 L至第至第2孔，依次倍比稀释至第孔，依次倍比稀释至第11孔，吸弃孔，吸弃50 L；第第12孔为红细胞对照。孔为红细胞对照。3.自右至左依次向各孔加入自右至左依次向各孔加入0.5%鸡红细胞悬液鸡红细胞悬液50 L，在振荡器上振荡，室温下静置后观察结果。在振荡器上振荡，室温下静置后观察结果。一、鸡新城疫的血凝试验(HA)【病毒血凝试验的操作方法（单位：【病毒血凝试验的操作方法（单位：L）】）】孔 号123456789101112病毒稀释度1:21:41:81:161:321:641:1281:2561:5121:10241:2048对照生理盐水505050505050505050505050病毒液5050505050505050505050 0.6%红细胞505050505050505050505050 微型振荡器1min，静置30min 弃50结果观察+-以以100%凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位一、鸡新城疫的血凝试验(HA)【结果判定结果判定】置于振荡器上振荡1分钟，静置后30 min开始观察结果，待对照孔红细胞已沉淀即可进行结果观察。红细胞全部凝集，沉于孔底，平铺呈网状，即为100%凝集（+），不凝集者（-）红细胞沉于孔底呈点状。以100%凝集的病毒最大稀释度为该病毒血凝价，即为一个凝集单位。从表4-1看出，该新城疫病毒液的血凝价为1:128，则l:128为1个血凝单位，1:64、l:32分别为2、4个血凝单位，或将128/4=32，即1:32稀释的病毒液为4个血凝单位。二、鸡新城疫的血凝抑制试验(HI)【材料】除血球凝集试验所用材料外，血清取鸡免疫血清。鸡群卵黄抗体的制备鸡群卵黄抗体的制备1.1.取鸡蛋卵黄取鸡蛋卵黄20ml20ml，加入等量生理盐水，加入等量生理盐水，振荡，摇匀。振荡，摇匀。2.2.加入等量氯仿加入等量氯仿40ml40ml，振荡，振荡3030分钟。分钟。3.3.取振荡的卵黄液取振荡的卵黄液300030004000rpm304000rpm30分钟。分钟。4.4.取上清液作为抗体检测材料取上清液作为抗体检测材料二、鸡新城疫的血凝抑制试验(HI)【方法】1.根据HA试验结果，确定病毒的血凝价，配制出4个血凝单位的病毒液。2.在96孔微量反应板上进行，用固定病毒稀释血清的方法，先在第1孔加50L生理盐水。3.自第3孔至12孔各加50L 4个血凝单位的新城疫病毒液。4.第孔加被检鸡血清50L，吹吸混合均匀，吸50L至第2孔，依此倍比稀释至第10孔，吸弃50L，稀释度分别为：1:、1:4、1:8 ；第12孔加新城疫阳性血清50L，作为血清对照。振荡混合均匀，置室温中作用20min。5.自第l孔至12孔各加0.5%鸡红细胞悬液50L，振荡混合均匀，室温下静置30-40min后观察结果二、鸡新城疫的血凝抑制试验(HI)孔 号 滴度lg2材料 12345678910111212345678910病毒对照对照8单位病毒504单位病毒50505050505050505050生理盐水50被检鸡血清50505050505050505050 弃500.6%红细胞505050505050505050505050 震荡混匀，室温30-40min结果观察-+【病毒血凝抑制试验的操作方法（单位：病毒血凝抑制试验的操作方法（单位：L）】以以100抑制凝集（完全不凝集）的被检血清最大稀释度为该血清的血凝抑制效价，即抑制凝集（完全不凝集）的被检血清最大稀释度为该血清的血凝抑制效价，即HI效价。效价。二、鸡新城疫的血凝抑制试验(HI)【结果判定】以100抑制凝集（完全不凝集）的被检血清最大稀释度为该血清的血凝抑制效价，即HI效价。凡被已知新城疫阳性血清抑制血凝者，该病毒为新城疫病毒。从表4-2看出，该血清的HI效价为1:64，用以2为底的负对数(-log2)表示，即6log2。