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质谱测试分析质谱测试分析蛋白质质谱鉴定流程蛋白质质谱鉴定流程样品酶解酶解片断一级质谱PMF肽指纹图谱串联质谱对库检索序列数据库成功鉴定PSMs及后筛选De-novo 序列分析未知蛋白胰蛋白酶酶解胰蛋白酶酶解l 采用含乙腈的脱色液脱色至胶块变为白色l 真空干燥仪中冷冻干燥l 蛋白质组学级胰蛋白酶酶解过夜l 采用含TFA和乙腈的溶液溶进行肽提取l 真空干燥l 采用含TFA和乙腈的溶液溶解样品并点样进行质谱测试质谱分析质谱分析 l ABI MALDI-TOF/TOF 4800 质谱仪l 先用MS反射模式得到一级图谱l 一级质谱激光总shots:800次l 选择5-10个母离子做MS/MS分析l 二级MS/MS激光总shots:2000次，碰撞能量1KV,CID on数据库检索数据库检索l 采用GPS Explore(V3.6，ABI)软件进行分析l 使用MASCOT（V2.1,Matrix Science,London,U.K）搜库软件对本地数据库进行检索l 检索数据库为NCBInr，切割的酶为trypsin，允许最大的未被酶切位点数为1,可变修饰为半胱氨酸乙酰胺化和甲硫氨酸氧化，没有固定修饰，母离子质量容差为50 ppm，片段离子质量容差为0.25Da肽指纹图谱肽指纹图谱（PMF）鉴定鉴定lPMF（Peptide Mass Fingerprinting）是根据一级质谱（MS）所测酶解片段的精确分子质量鉴定蛋白质的一种方法 l一般采用MALDI-TOF进行鉴定。因为MALDI质谱图中的离子一般只带一个电荷，比较容易计算l其原理就是利用了蛋白序列数据库中的多肽质量的信息与实际测得的质量信息进行对比而实现鉴定优点与缺点优点与缺点优点：l是用一级质谱鉴定蛋白质的经典方法，算法简单，速度快缺点：l质量相近的多肽增加匹配难度l无法实现混合蛋白的鉴定二级质谱鉴定二级质谱鉴定l质谱仪选择一级质谱中的一个峰，让这些峰所代表的离子高速撞击质谱仪中的惰性气体，使其肽键断裂，并对库搜索鉴定蛋白质l常用MALDI-TOFTOF仪器进行优点与缺点优点与缺点优点：l鉴定准确度更高，可以得到蛋白的序列l可以实现多个蛋白的鉴定缺点：l增加了一步操作l算法更复杂，而且需要更多的操作经验串联质谱结果串联质谱结果质谱图质谱图从一级质谱图里选出部分峰做二级质谱一级质谱图二级质谱图蛋白点编号蛋白名称蛋白GI号串联质谱匹配的序列理论等电点理论分子量串联质谱离子得分可信度串联质谱结果串联质谱结果报告单报告单蛋白得分蛋白的选择蛋白的选择l一般以protein score C.I.%大于95或者单个肽段的Total Ion C.I.%大于95作为蛋白成功的标准l对于一个样品点鉴定得到多个成功鉴定的结果，以蛋白得分（protein score）最高的最为可信l一般而言，多个成功鉴定的不同蛋白之间相似性也是非常高的，也可以通过这个特点来判定结果的可靠性蛋白信息查询蛋白信息查询l首先根据蛋白名称可以了解该蛋白的大致功能l使用该蛋白的GI号码可以到NCBI数据库进一步查询该蛋白的信息l对于未知蛋白，可以采用BLAST或者其它功能预测软件预测该蛋白的功能