血清碱性磷酸酶活性测定.ppt

血清碱性磷酸酶活性测定磷酸苯二钠法ALP 实验目的 实验原理 实验器材与试剂 实验操作 计算 临床意义 注意事项 思考掌握酶活力测定的一般方法掌握血清中ALP活力测定方法掌握血清中ALP测定的临床意义 如何测定酶活力的大小如何测定酶活力的大小？酶活力酶活力：常用单位时间内底物的减少量或产物的生成量来表示 碱性磷酸酶碱性磷酸酶ALP是一组在是一组在碱性环境碱性环境中中水解磷酸酯水解磷酸酯的酶类。的酶类。来源：广泛分布于人体的骨、肾、肝、肠、血清、来源：广泛分布于人体的骨、肾、肝、肠、血清、胆汁等部位，但骨骼、牙齿、肾和肝脏中含量较胆汁等部位，但骨骼、牙齿、肾和肝脏中含量较多。正常人血清中多。正常人血清中ALP主要来源于主要来源于肝脏肝脏。是一种能够将对应底物是一种能够将对应底物去磷酸化去磷酸化的酶，即通过水的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团磷酸基团除去，并生除去，并生成成磷酸根离子磷酸根离子和和自由的羟基自由的羟基，这类底物包括核酸、，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。而该脱去磷酸基团的过程称为蛋白、生物碱等。而该脱去磷酸基团的过程称为去磷酸化或脱磷酸化。去磷酸化或脱磷酸化。碱性磷酸酶在碱性环境中有最大活力。碱性磷酸酶在碱性环境中有最大活力。在PH=10的环境中，ALPALP催化磷酸苯二钠磷酸苯二钠水解 苯酚苯酚和磷酸氢二钠磷酸氢二钠 苯酚苯酚与4-4-氨基安替比林氨基安替比林 色素原色素原 该色素原经铁氰化钾铁氰化钾氧化生成红色醌亚胺衍生物醌亚胺衍生物 测定红色物质的吸光度就可以计算酶活力的大小。(ALP,PH=10)苯酚+磷酸氢二钠 醌亚胺衍生物醌亚胺衍生物。4一氨基安替比林用量与吸光度成正相关，需准确加入。铁氰化钾用量不一氨基安替比林用量与吸光度成正相关，需准确加入。铁氰化钾用量不足时，反应不完全，测量结果偏低，因此铁氰化钾用量必须加足或稍稍过量足时，反应不完全，测量结果偏低，因此铁氰化钾用量必须加足或稍稍过量 ALP活性金氏单位定义:每100ml血清再37摄氏度时与底物作用15分钟，产生酚1mg为1金氏单位。ALP活性=(At-Ac)/(As-Ab)*0.05*100(金氏单位)酚标准液开后不能久置。底物液不能含有酚，若含酚则显红色，说明磷酸苯二钠已分解，不宜使用。加入铁氰化钾后必须迅速混匀(为了改变PH来终止酶促反应），否则有影响，偏大。铁氰化钾溶液中加入硼酸有稳定最后所显色的作用。此液应避光保存，如出现蓝绿色即作废。1.本次实验是用的什么方法？终止剂是什么？为什么加入铁氰化本次实验是用的什么方法？终止剂是什么？为什么加入铁氰化钾硼酸液后必须迅速混匀？有何影响？钾硼酸液后必须迅速混匀？有何影响？答：终止法；终止剂是答：终止法；终止剂是 铁氰化钾硼酸液；硼酸改变了铁氰化钾硼酸液；硼酸改变了PH，使其，使其不再处于最适不再处于最适PH。加入物（ml)0 12345酚标准应用液00.20.40.60.81.0蒸馏水1.10.90.70.50.30.1碳酸盐缓冲液1.01.01.01.01.01.0铁氰化钾溶液3.03.03.03.03.03.0相当于金氏单位01020304050。磷酸对硝基酚连续监测法 在碱性条件下，碱性磷酸酶将无色磷酸对硝基苯酚水解为黄色对硝基苯酚，在 405nm测定对硝基苯酚生成的速率，这个速率与血清中ALP活性成正比。反应需要Mg2+作为激活剂。