自噬相关蛋白BeclinLC3的表达与BRAF基因突变在甲状腺乳头状癌中的关系及其临床意义.docx
自噬相关蛋白BeclinKLC3的表达与BRAF基因突变在甲状腺乳头状癌中的关系及其临床意义郑俊杰1游振辉11-福建省立医院基本外科福建福州350001第一作者：郑俊杰，福建省立医院基本外科电话：e-mail：通讯作者：游振辉，福建省福州市东街134号，电话：，e-mail：【摘要】目的：探究甲状腺乳头状癌中自噬相关蛋白Beelin1、LC3的表达和BRAF基因突变的关系及临床意义。方法：免疫组化法检测89例甲状腺乳头状癌病理标本的BeclinELC3的表达情况，并检测BRAF基因突变情况，分析二者的关系。结果：L甲状腺癌组织中Beclinl阳性率为36.0%(32/89),显著低于癌旁组织中的66.3%(59/89)(X2=16.390,P<0.01)；LC3阳性率为25.8%(23/89),显著低于癌旁组织中的53.9%(48/89)(X2=14.644,PVOoD，差异具有统计学意义。2.乳头状甲状腺癌癌组织中Beclinl低表达与淋巴结转移有关(P<0.05)。3.Beclinl表达和BRAF基因突变在甲状腺乳头状癌中呈正相关关系(r=0.210,P<0.05)；LC3表达和BRAF基因突变在甲状腺乳头状癌中同样呈正相关关系(r=0.222,P<0.05)；BeCIinl表达和LC3表达在甲状腺乳头状癌中呈正相关关系(r=0.360,P<0.05)o结论：LBeCIinI和LC3在甲状腺乳头状癌中低表达。2.Bcclinl的低表达与淋巴结转移有关，提示自噬水平降低可能增强甲状腺乳头状癌的侵袭性。3.在甲状腺乳头状癌中BRAF基因突变可激活自噬。【关键词】自噬；Beclinl;LC3；甲状腺乳头状癌；BRAF基因TherelationshipbetweenBRAFgenemutationandExpressionofautophagyrelatedproteinBeclinlandLC3inpapillarythyroidcarcinomaanditsclinicalsignificanceAbstractObjective:ToinvestigatetherelationshipbetweenBRAFgenemutationandExpressionofautophagyrelatedproteinBeclinlandLC3inpapillarythyroidcarcinomaanditsclinicalsignificance.Methods:theexpressionofBeclinlandLC3wasdetectedin89casesofpapillarythyroidcarcinomabyimmunohistochemicalmethod.TheBRAFgenemutationwasdetectedandthecorrelationbetweenthemwasanalyzed.Results:1.thepositiveexpressionrateofBeclinl1inthyroidcarcinomawas36%(32/89),wassignificantlylowerthanthatintheadjacenttissues66.3%(59/89)(X2=16.390,P<0.01);thepositiveexpressionrateofLC3was25.8%(23/89),wassignificantlylowerthanthatintheadjacenttissues53.9%(48/89)(X2=14.644,P<0.01),thedifferenceswereStatistieallysignifican.2.LowexpressionofBeclinlinpapillarythyroidcarcinomaisassociatedwithlymphnodemetastasis(P<0.05).3.TherewasapositivecorrelationbetweenBeclinlexpressionandBRAFgenemutationinpapillarythyroidcarcinoma(r=0.210,P<0.05).TherewasapositivecorrelationbetweenLC3expressionandBRAFgenemutationinpapillarythyroidcarcinoma(r=0.222,P<0.05).TherewasapositivecorrelationbetweentheexpressionofBeclinlandLC3inpapillarythyroidcarcinoma（r=0.360,P<0.05）.Conclusion:1.BeclinlandLC3werefoundlowexpressioninpapillarythyroidcarcinoma.2.ThelowexpressionofBeclinlisassociatedwithlymphnodemetastasis,suggestingthatthedecreaseofautophagymayenhancetheinvasivenessofpapillarythyroidcarcinoma.3.BRAFgenemutationcanactivateautophagyinpapillarythyroidcarcinoma.Keywordsautophagy；Beclinl；LC3；papillarythyroidcarcinoma；BRAFgene甲状腺癌是近年来在全世界范围内发病率增长最快的恶性肿瘤，其中甲状腺乳头状癌是甲状腺癌中最常见的类型。1-4BRAF基因与甲状腺乳头状癌的关系密切。甲状腺乳头癌中BRAF基因突变率达29%-83%o2BRAF基因位于7号染色体，是编码细胞质丝氨酸/苏氨酸激酶，影响丝裂原活化途径蛋白激酶（MAPK）的活化过程，BRAF基因突变激活的MAPK促进细胞增殖、抑制分化与凋亡，是甲状腺乳头状癌发生发展中的分子事件之一，促进肿瘤的侵袭性。其中点突变致催化中心附近的600密码子的级氨酸被谷氨酸替代的BRAFV600E基因突变最为常见。5-6自噬是溶酶体降解异常蛋白和受损或多余的细胞器的囊泡过程。自噬是细胞内环境稳定的重要作用，对癌症的发生、发展起着复杂的作用，通常在肿瘤发生的早期，细胞自噬呈抑制肿瘤的作用；当肿瘤形成后，细胞自噬又可促进肿瘤细胞的生长。7但BRAF基因突变与自噬水平在甲状腺乳头状癌中的关系目前研究不多，仍存在较多争议及不同的研究成果，本实验通过免疫组化检测自噬相关蛋白Beclinl和LC3表达情况代表自噬水平同时检测BRAFV600E基因突变情况，分析二者的关系，为甲状腺乳头状癌的发生机制、诊断治疗方面提供临床数据。材料与方法1 .一般资料：本研究收集并筛选出福建省立医院2016年1月-2016年3月间经规范手术治疗89例甲状腺乳头状癌的手术标本，所有病例均为初治病人，术前未接受甲状腺相关治疗。排除条件：病灶过小无法采集及未行BRAF基因检测，同时排除合并甲状腺其他类型的恶性肿瘤。以癌旁组织作对比，癌旁组织病变包括结节性甲状腺肿，桥本，弥漫性甲状腺肿大。其中男27例，女62例，45岁及以上53例，小于45岁36例，病灶直径大于ICm36例，小于等于ICm53例，单发48例，多发（包括双侧）41例,腺外侵犯59例，无腺外侵犯30例,淋巴结转移52例，无淋巴结转移37例，临床分期：ITI期53例，11HV期36例。2 .方法：主要试剂：本实验中所用一抗（兔抗人）均购自BioworldTechnology,Inc.l抗（酶标抗小鼠/兔IgG聚合物）及DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术有限公司。免疫组化（EIiViSiOnSUPer法）：首先，将标本切片在60条件下孵化IOinin,然后置于二甲苯中脱蜡30min,用浓度逐步降低的乙醇溶液继续脱蜡去水10min0用热修复法修复抗原以提高抗原的暴露程度后室温下用0.3%的H202抑制内源性的过氧化物酶活性Iomin。PBS冲洗后用一抗孵化1h,反应增强剂孵化20min后二抗孵化30min。用DAB显色在室温下显色5min,苏木精染色5min0阴性对照组为PBS液。BRAFV600E基因检测方法：提取DNA：操作步骤按照说明书进行。BRAF基因V600E突变的检测：操作按照说明书进行。3 .结果判断：染色强度评分：无色：O分，浅色：1分，棕黄色：2分，棕褐色：3分；阳性细胞所占百分比评分：每张切片选取5个高倍视野，分别计数每一视野中阳性细胞占总细胞数的百分比,其平均数为该阳性细胞百分比的结果,0-9%为0分,10%-25%为1分，26%-50%为2分，51%-75%为3分，76%TO0%为4分。以染色强度与阳性细胞百分比乘积来评价蛋白的表达强度，本研究为方面统计，BeClinl表达(一)：0-3分；(+):大于4分；LC3阴性及低表达(一)：0-6分；高表达：大于6分。4 .统计学方法：采用SPSS22.0软件，各组之间的比较分析采用卡方检验。两变量之间相关关系的研究应用SPearmarl相关分析。以P<0.05为差异有统计学意义。结果1. Beclinl和LC3在甲状腺乳头状癌组织中的表达水平及BRAF基因突变率：甲状腺癌组织中Beclinl阳性率为36.0%(32/89),显著低于癌旁组织中的66.3%(59/89)(X2=16.390,P<0.01)；LC3阳性率为25.8%(23/89),显著低于癌旁组织中的53.9%(48/89)(X2=14.644,PVO.01),差异具有统计学意义。表1：Beclinl和LC3在甲状腺乳头状癌组织中的表达水平BeclinlX2/P值LC3X2/P值(+)(一)(十)(一)癌组织325716.390<0.01236614.644<0.01癌旁组织59304841BRAF基因突变率87.6%(78/89)。在甲状腺肿瘤中，BRAF突变发生只有在甲状腺乳头状癌和一部分甲状腺未分化癌，未在甲状腺良性肿瘤、滤泡癌或髓样癌发现。2故本研究未对良性病变行BRAF基因突变检测。2. Beclinl和LC3在甲状腺乳头状癌组织中的表达水平与临床病理参数关系：乳头状甲状腺癌癌组织中Beclinl阳性表达与年龄、性别、病灶大小、单发多发、腺外侵犯程度和临床分期无关无关(P>0.05),与淋巴结转移有关(P<0.05)OLC3的阳性表达与乳头状甲状腺癌的年龄、性别、病灶大小、单发多发、腺外侵犯程度、有无淋巴结转移和临床分期无关(P>005)O表2：Beclinl和LC3在甲状腺乳头状癌组织中的表达水平与临床病理参数的关系临床病理参数nBeclinlX2/P值LC(+)X2/P值+-+-年龄<453612240.180/0.67111250.701/0.4032455320331241性别男2711160.385/0.5357200.000/0.991女6221411646病灶大小lcm5315383.333/0.06812410.701/0.403>lcm3617191125单发多发单发4819290.596/0.44010381.364/0.243多发4113281328腺外侵犯无301416
