明胶酶谱法.docx
明胶酶谱检测（GelatinZymography）明胶酶谱法（Zymography）是基于SDS-PAGE电泳和反相凝胶染色的蛋白酶检测方法来检测MMP-2、MMP-9活性，其灵敏度可达IOpg,高于ELISA方法。其基本原理和程序是：以加有底物明胶的SDS-PAGE凝胶分离含蛋白酶的样品，电泳结束后取出凝胶与酶反应Buffer孵育，凝胶染色与脱色。凝胶中由于含底物明胶而被深染，形成深色背景，但在有蛋白酶条带的位置，蛋白酶将降解凝胶中的明胶蛋白，因而不被染色而形成白色条带，能同时指示MMP-2、MMP-9的位置（酶谱）。该方法具有如下特点：半定量分析MMPS活性，可区分酶原和活化型酶两种形式.可检测样本有血液、渗出液、组织细胞提取物等。酶谱法的基本过程是先将样品进行SDS-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE,含0.1%明胶）电泳分离，然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的MMP-2和MMP-9恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色，在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与MMP-2和MMP-9活性成正比。复性原理：在电泳过程中,SDS与样品中的MMPS结合（当然是可逆性结合），破坏其氢键、疏水键而使MMPS不能发挥其分解明胶的作用，而只有当将胶置Trition中洗脱（最好是放在摇床上摇，30min/次，做2次或15min次，4次。静置于Tritiorl中是不妥的。）时，由于SDS被Trition结合而去除，从而使MMPs恢复了活性。试剂的配制（配方有可能是错的!）（1）配制10%SDS聚丙烯酰胺凝胶（含LOmg/ml明胶，配好后工周内使用，明胶含量低灵敏度高）A.分离胶的配制（注：根据你所用的电泳仪胶的大小确定配制胶的量）10%SDS聚丙烯酰胺凝胶IOmI（包括）ddH2O4.5ml30%储备胶（0.8%BIS+292%丙烯酰胺）2ml1.5mollTris（PH8.8）2.5ml10%SDS100uI10%过硫酸镂（APS）100uITEMED8ul1%明胶（Ig明胶->100ml,37。C水浴溶解）0.5mlB,浓缩胶的配制浓缩胶6mlddH204.5ml30%储备胶0.75mllmollTris-HCL(PH6.8)0.76ml10%SDS60ul10%过硫酸镂60ulTEMED6ul(3) 5xTris-甘氨酸电极缓冲液0.125mollTris-HCL,1.25moll甘氨酸，0.5%SDS(PH8.3)(4) 4X上样缓冲液0.32%Tris-HCL6.4ml4%SDS(PH7.2)8ml16%甘油3.2ml澳酚蓝0.024gddH2O2.4ml(5)洗脱液25%TritonX-100,50mmolLTris-HCI,5mmolLCaCI2,pH7.6(40分钟两次，中间换液)(6)漂洗液:50mmolLTris-HCI,5mmolLCaCI2,pH7.6(20分钟2次)(7)孵育液：50mmolUriszpH7.5,150mmolLNaCI,10mmolLCaCI2z0.02%NaN3(孵育42小时)(8)染色液：0.05%Coomassic亮蓝R-250,30%甲醇，10%乙酸（染色3小时）（9）脱色液A、B、C：甲醇浓度分别为30%、20%、10%,乙酸浓度分别为10%、10%、5%（分别30mhlh>2h脱色）实验步骤1.取对数期的癌细胞在的无血清培养基DMEM中培养24ho2,次日收集上清液，将上清液移入离心管中200OrPm离心IOmin,70储存备用。3 根据细胞计数调整各组细胞培养上清液中的蛋白浓度（或者测定蛋白浓度调整使所上蛋白总量一致）。与5x上样缓冲液混合，13Ul样本+4ul上样缓冲液。（不要用枪用力吹打，防止出现过多气泡）4 .配制分离胶和浓缩胶，16ul孔上样（根据表达强度和蛋白浓度确定上样量），4进行SDS-PAGE电泳IOoV约1.5小时（电泳时在周围敷上冰，有利于使条带跑直）。5 .电泳结束后,将凝胶置于洗脱液（2.5%TritonX-100,50mmolLTris-HCI,5mmolLCaCI2,pH7.6）中振荡洗脱2次,每次40分钟,然后用漂洗液（除不含TritonX-100外其余同洗脱液）漂洗2次,每次20分钟,接着,将凝胶置于孵育液（5Ommol/LTris-HCI,5mmolCaCI2,0.02%Brij-35zpH7.6）中37。孵育42k6 .孵育结束后经染色液（0.05%Coomassic亮蓝、30%甲醇、10%乙酸）染色3h,及脱色液A、B、C（甲醇浓度分别为30%、20%、10%,乙酸浓度分别为10%、10%、5%）分别脱色0.5、1、2h后，显示出MMP-2(72KD)和MMP-9(92KD)为位于蓝色背景上的透亮带,用凝胶图像分析系统分析读取条带面积，宽度和灰度值，做统计分析。注意事项：1.制备聚丙烯酰胺时应注意排除气泡。2 .明胶酶谱的活性受钙离子，锌离子，和PH值等因素的影响，因此缓冲液配制应严格准确，尽量用超纯水，孵育温度也掌握好。3 .用大梳子4 .孵育液的PH最好在7.5-7.6,复性的TRITON时间长了会有絮状物,所以实验时尽量使用新鲜配置的。5,孵育的37度不要在C02培养箱中，因为会改变孵育液的PH值，在普通孵箱即可。6,明胶要4度保存，配好后1周内使用凝胶制备：1 .玻璃板对齐后放入夹中，垂直卡紧，加满水检漏。2 .配10%分离胶，APS和TEMED作用为促凝，最后灌胶前加。若板不漏水，则将水倒出，并用吸水纸洗净后灌胶，灌至大约3/4处，上面加满水压平。3 .配浓缩胶，同样地，APS和TEMED最后力口，分离胶灌入约30min后观察小烧杯中剩余分离胶是否已凝，同时仔细观察可见玻板水和胶间有一条折线，说明胶已凝固。4 .将上面的水倒去，吸水纸洗净，灌入浓缩胶，灌满，注意一定不要有气泡，然后将梳子插入，注意保持水平，约30min后凝固可用。5 .拔梳子在电泳缓冲液中拔，加样孔用小针筒冲洗干净再上样，注意上样时勿使样品逸至邻孔，样品混匀时要轻，不要产生气泡，否则加样时易导致逸出而使结果不准确。
