碱性磷酸酶AKPALP活性测定试剂盒说明书.docx

碱性磷酸酶（AKPALP）活性测定试剂盒说明书微量法IoOT/48S注意t正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。测定意义：AKP/ALP是一种含锌的糖蛋臼衡，在碱性环境中可水解各种天然及人工合成的磷脂单酯化合物。AKP/ALP广泛分布于人体各脏器中，以肝脏为主。测定原理：在碱性环境中，AKP/ALP催化磷酸苯二钠生成游离酚；酚与4-氨基安替比林和铁氧化钾反应红色亚醍衍生物，在510nm有特征光吸收；通过测定510nm吸光度增加速率，来计第AKP活性。自备仪器和用品：可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、台式离心机、水浴锅、可调式移液器和蒸谣水。试剂组成和配制：试剂一：液体Xl瓶，4C保存。试剂二：液体Xl瓶，4C避光保存。试剂三：液体Xl瓶，4C避光保存。试剂四：液体Xl瓶，4C避光保存，未变成蓝绿色之前均可使用。标准品：液体xl支（EP管中），2molmL酚标准液，4*C保存。粗*液提取:加入试剂四120L,混匀后于51Onm测定吸光度，记为A测定管。其中标准管和空R管只需做一管，测定管和对照管每个样均需做。注意：空白管和标准管只需测定一次。1.2.3.组织：按照组织质量（g）：试剂一体积（mL）为1： 510的比例（建议称取约0.1g组织，加入ImL试剂 一）进行冰浴匀浆，4匕、800Og离心IOmin,取上清液待测。细菌或细胞：按照细菌或细胞数量（IO。个）：试剂一体积（mL）为5001000: 1的比例（建议500万 细胞加入ImL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w,超声3秒，间隔7秒，总时间3min）：然 后8000g, 4C,离心Iomin,取上清置于冰上待测。血液可直接测定，或者适当稀释后测定。测定步骤：1 .分光光度计/酶标仪预热30min,调节波长到510nm,蒸储水调零。2 .试剂三置于37tC水浴中预热30 min。3 .空白管：取EP管，加入4人蒸储水，40L试剂二，40L试剂三, 加入试剂四120L,混匀后于51Onm测定吸光度，记为A空白管。4 .标准管：取EP管，加入4匹标准品，40L试剂二，40L试剂三, 加入试剂四120L,混匀后于510nm测定吸光度，记为A标准管。5 .对照管：取EP管，加入L上清液，40L蒸储水，40L试剂三, 加入试剂四120L,混匀后于51Onm测定吸光度，记为A测定管。6 .测定管：取EP管，加入4匹上清液，40L试剂二，40L试剂三,混匀后置于37水浴中保温15min;混匀后置于37水浴中保温15min;混匀后置于37水浴中保温15min;混匀后置于37水浴中保温15min;AKP/ALP活性计算：1 .血液中AKP/ALP活力计算活性单位定义：37中每亳升血液每分钟催化产生lmol酚定义为1个酶活单位。AKP/ALP活力（molminZmL）=C标准品X（A测定管A对照管）÷（A标准管A空白管）xV反总÷V样÷T=6.8×（A测定管A对照管）÷（A标准管-A空白管）2 .组织、细菌或细胞中AKP/ALP活性计算（1）按照蛋白浓度计算活性单位定义：37C中每亳克蛋白每分钟催化产生1mol酚定义为1个醉活单位。AKPALP（molminmgprot）=C标准品X（A测定管-A对照管）11A标准管-A空白管）xV反总÷（CprxV样）÷T=6.8x（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷Cpr（2）按照样本质量计算活性单位定义：37C中每克组织每分钟傕化产生1mol酚定义为1个麻活单位。AKPALP（molming鲜重）=C标准品X（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）xV反总÷（WxV样÷V样总）÷T=68x（A测定管-A对照管）÷（A标准管-A空白管）÷W（3）按照细菌或细胞数量计算活性单位定义：37*C中每IO4个细菌或细胞每分钟催化产生1mol酚定义为1个酶活单位。AKP/ALP（molmin104cell）=C标准品X（A测定管A对照管）÷（A标准管-A空白管）xV反总÷（细胞数量XV样÷V样总）÷T=6.8×（A测定管-A对照管）÷（A标准管A空白管）÷细胞数量C标准品：2molmL;V反总：反应体系总体积（mL）,205L=0.205mL;Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mgmL）,需要另外测定，建议使用本公司生产的BCA蛋H质含量测定试剂盒；W：样品质量；V样：加入反应体系中上清液体积（mL）,0.004mL；V样总：提取液体积，1mL；T：反应时间（min）,15min。注意事项：1.试剂二、试剂三和试剂四均需避光保存。3 .试剂四变蓝绿色后不能再使用。4 .加入试剂四后必须立即混匀，否则显色不完全。