动物源产气荚膜梭菌分离与鉴定技术规程（征求意见稿）.docx

ICS67.120.10CCSX22NY中华人民共和国农业行业标准NYTXXXX-XXXX动物源产气荚膜梭菌分离与鉴定技术规程TechnicalcodeofpracticeforisolationandidentificationofClostridiumperfringensfromanimalsXXXX-XX-XX 发布（送审稿）XXXX-XX-XX实施中华人民共和国农业农村部本文件按照GB/T1.1-2020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。请注意本标准的某些内容可能涉及专利。本文件的发布机构不承担识别专利的责任。本文件由农业农村部畜牧兽医局提出。本文件由全国兽药残留与耐药性控制专家委员会归口。本文件起草单位：中国农业大学，中国兽医药品监察所。本文件起草人：王少林，赵琪，吴聪明，张纯萍，张仕泓，王鹤佳，周宇晴，徐士新，陈安杰，崔明全，李霆，程敏。动物源产气荚膜梭菌分离与鉴定技术规程1范围本文件确立了动物源产气荚膜梭菌(CIOSiridiIanPelfrigens)分离与鉴定的程序，规定了样品采集与保存运输、分离纯化、筛查与鉴定、菌种保藏、生物安全要求的操作指示，描述了相应的试验方法。本文件适用于动物源细菌耐药性监测对动物直肠/泄殖腔拭子、新鲜粪便、肠道内容物等样品中产气荚膜梭菌的分离和鉴定。2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本(包括所有的修改单)适用于本文件。GB4789.13食品安全标准食品微生物学检验产气荚膜梭菌检验GBZT6682分析实验室用水规格和试验方法GB19489实验室生物安全通用要求NY"1948兽医实验室生物安全要求通则NYf4141动物源细菌耐药性监测样品采集技术规程3术语与定义本文件没有需要界定的术语和定义。4试剂或材料1.1.1 1要求除另有规定外，所有试剂均为分析纯，水为符合GBZT6682规定的三级水，培养基按附录A配制或用商品化产品。1.1.2 2试剂4.2.1 灭菌液体石蜡。4.2.2 PCR预混液(2×PCRMasterMix)o4.2.3 50XTAE缓冲液。4.2.4 琼脂糖。4.2.5 DNAMarker(2000bp)。4.2.6 a-甄-4-羟基肉硅酸(HCCA)o4.2.7 甘油。4.2.8 3溶液制备1.1.1 1IXTAE缓冲液：取50XTAE缓冲液20mL,加水至IOOOmL。1.1.2 4琼脂糖凝胶:取琼脂糖L0g,于100mLIXTAE中加热，充分溶解。1.1.3 基质溶液：取a-鼠-4-羟基肉硅酸(HCCA),按说明书配制，或用市售商品。1.1.4 灭菌甘油:取甘油适量，121高压灭菌20111。1.1.5 4培养基制备4.4.1AmieS运送培养基：按照附录A中A.1的规定执行。4.4.2液体硫乙醇酸盐培养基(FTG)：按照A.2的规定执行。4.4.3胰月东-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂培养基(TSe)：按照A.3的规定执行。4.4.45%绵羊血琼脂培养基：按照A.4的规定执行。44.55%蔗糖脱脂乳保护剂：按照A.5的规定执行。4.5标准菌株产气荚膜梭菌毒素C型(ClOSiridiMnlpefngens,TypeC)CVCC60101o4.6材料4.6.1无菌脱纤维绵羊血。4. 6.2生化鉴定试剂盒或鉴定卡。5. 6.3细菌DNA提取试剂盒。6. 6.4磁珠保藏管。5仪器设备6.1 二级生物安全柜。6.2 冰箱：28,-20C或以下。5. 3分析天平：感量0.01g。5.4 精密天平：感量0.001g。5.5 移液器：0.5LIOooL°7. 6恒温培养箱。5.7厌氧培养装置。5. 8微生物生化鉴定系统。5.9PCR仪。5. 10高速冷冻离心机：离心速度12000rmin°5.11 核酸电泳仪。5.12 电泳凝胶成像分析系统。5.13微生物质谱仪(MALDI-TOfMS)o6分离鉴定程序分离与鉴定流程见图1。图1产气荚膜梭菌分离与鉴定流程7样品采集与保存运输样品采集与保存运输按照NY/T4141的规定执行。8分离纯化8.1 预增菌8.1.1 动物直肠/泄殖腔拭子取样品液2OOL,置FTG培养基2mL中，混匀，液体石蜡封固，36C(+1)厌氧培养20h24ho8.1.2 新鲜粪便、肠道内容物取样品适量，置FTG培养基2mL中，混匀，液体石蜡封固，36(±1)厌氧培养20h24ho8. 2增菌取预增菌液ImL、约50的TSe琼脂培养基9mL,倾注平皿，缓慢旋转混匀，室温凝固。再加入约50的TSC琼脂培养基IOmL,室温凝固，正置，36(±1)厌氧培养20h24h.8.3纯化挑取圆形黑色单菌落，接种5%绵羊血琼脂培养基，36C(±lC)倒置厌氧培养20h24h。挑取有溶血环、表面光滑菌落，接种5%绵羊血琼脂培养基，36(±1)倒置厌氧培养20h24h,纯化，备用。9筛查与鉴定9.1筛查9.1.1形态学检查取纯化菌落，按照GB4789.13规定执行。9.2鉴定9.2.1通则生化鉴定、PCR鉴定和质谱鉴定3种方法任选其一。9.2.2生化鉴定按照GB4789.13规定执行，也可以使用生化鉴定试剂盒、鉴定卡或微生物生化鉴定系统鉴定。9.2.3PCR鉴定9.2.3.1模板制备取新鲜的纯化菌落，加灭菌水ImL,煮沸IOmin,冰浴冷却，12000面皿离心3111抽。取上清液，备用。或使用细菌DNA提取试剂盒提取DNA作为模板。产气荚膜梭菌标准菌株作为阳性对照，水为阴性对照。9.2.3.2引物引物序列及扩增片段长度见表k表1产气荚膜梭菌的PCR引物序列及扩增片段长度细菌引物序列扩增片段长度，bp产气英膜梭菌上游引物（CPa-F）:5'-GCTAATGTTACTGCCGTTGA-3'下游引物（Sa-R）:5'-CCTCTGATACATCGTGTAAG-3,3249.2.3.3反应体系反应体系(30L)见表2。表2PCR反应体系试剂体积，L2×PCRMasterMix15上游引物(10molL)1下游引物(10moIL)1水CddH2O）12模板19.2.3.4反应条件94预变性5min；94变性30s,55退火30s,72延伸30s,30个循环；72延伸10min。9.2.3.5电泳取PCR扩增产物，于1%的琼脂糖凝胶中电泳，凝胶成像分析。9. 2.3.6结果判定扩增条带大小符合324bp的为阳性。阳性扩增产物必要时测序比对鉴定，相似度不低于99%。产气荚膜梭菌PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果和测序结果见附录B中B.1和B.2。10. 2.4质谱鉴定11. 2.4.1菌样制备挑取单个新鲜纯化菌落，均匀涂布于靶板样品孔中，室温干燥。吸取1L基质溶液滴于样品上，混匀，室温干燥。标准菌株的新鲜菌落同法操作。12. 2.4.2仪器校准检测样品前，应对微生物质谱仪进行校准。13. 2.4.3测定取制备好的样品靶板，置质谱仪靶板槽中。编辑样品信息后，进行谱图的数据采集。14. 2.4.4结果判定微生物质谱仪自动完成谱图的比对和鉴定。以不同分值显示结果，鉴定分值达到种水平可信即可。产气荚膜梭菌毒素C型标准菌株质谱鉴定谱图见附录C。10菌株保藏取新鲜纯化菌，加入含有5%无菌脱纤维羊血的FTG培养基制成菌悬液，与灭菌甘油溶液混合，使甘油终浓度为20%40%;或加入磁珠保藏管；或加入5%蔗糖脱脂乳保护剂，冻干。-20或以下保藏。11生物安全要求实验室设施设备、人员防护及实验的安全操作、实验废弃物和菌种的处理应符合GB19489和NYb1948的要求。附录A（规范性）培养基A.1Amies运送培养基A.1.1成分氯化钠3.0g磷酸二氢钾0.2g磷酸氢二钠1.15g氯化钾0.2g氯化镁0.1g硫代乙醇酸钠.0g氯化钙0.1g琼脂7.5g水IOOOmLA.1.2制法将A.1.1中各成分加入水中，混匀，加热煮沸至完全溶解，调节PH至7.3±O.l,12Ie高压灭菌15min,备用。A.2液体硫乙醇酸盐培养基（FTG）A.2.1基础液胰蛋白陈15.0gL-胱氨酸0.5g酵母粉5.0g葡萄糖5.0g氯化钠2.5g硫乙醇酸钠0.5g刃天青0.001g琼脂0.75g水1000mL将A.2.1中各成分加入水中，混匀，调节PH值至7.1±0.2,121高压灭菌15min,备用。A.2.2制法基础液D-环丝氨酸1000mL80mL将各成分混匀，备用。A.3胰豚-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂培养基（TSC）胰陈15.0g大豆陈5.0g酵母粉5.0g焦亚硫酸钠1.0g柠檬酸铁核1.0g琼脂15.0g水IOOOmlA.3.1基础液将A.3.1中各成分加入水中，混匀，调节PH值至7.3±0.2,12Ic高压灭菌15min,备用。A.3.2制法基础液D.环丝氨酸IOOOmL80mL将各成分混匀，备用。A.45与绵羊血琼脂培养基A.4.1成分蛋白陈IO-Og牛脑浸粉12.5g葡萄糖2.0g牛心浸粉5.0g氯化钠5.0g磷酸氢二钠2.5g琼脂15.0g水IOOOml将A.4.1中各成分加入水中，混匀，调节pH值至7.4±0.2,121°C高压灭菌15min。冷却至约50,备用。A.4.2制法基础液IOOOmL无菌脱纤维绵羊血200ml将各成分混匀，倾注平板，备用。A.55与蔗糖脱脂乳保护剂A.5.1成分IO-Og5.0 g IOO mL脱脂乳蔗糖水将人.5.1中各成分混匀，112高压灭菌20111,备用。附录B（资料性）产气荚膜梭菌PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果和测序结果8.1 PCR产物琼脂糖凝胶电泳结果见图B.1。2000bpIOOObp750bp 500bp 250bpIOObp12345678M9标引序号说明：M-2000bp DNA Marker：1-7-为产气荚膜梭菌：8”为阳性对照(CVCC 60101)；9-为阴性对照(ddHzO)。图B.1产气荚膜梭菌PCR产物电泳图8.2 目标片段测序结果见如下。GctaatgttactgccgttgaccgcgcaggacatgttaagtttgagacttttgcagaggaaAGAAAAGAAcAGTATAAAATAAACACAGCAGGTTGCAAAACTAATGAGGATTnTATGCTgatatcttaaaaaacaaagattttaatgcatggtcaaaagaatatgcaagaggttttgcTaaaacaggaaaatcaatatactatagtcatgctagca