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    肺癌开题报告.ppt

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    肺癌开题报告.ppt

    黄芪对肺癌小鼠模型的干预机黄芪对肺癌小鼠模型的干预机制研究制研究 选题依据选题依据 选题目的:选题目的: 通过建立小鼠肺癌模型,探讨黄芪对肺癌的抑制和转移的作用机制,以期在临床上能有效的运用黄芪对肺癌治疗提供实验依据。建立肺癌小鼠肺模型,观察黄芪对小鼠生存时间,小鼠瘤组织的重量及抑瘤率、小鼠肺转移灶的影响。采用免疫组化方法,观察黄芪对小鼠肿瘤坏死因子及基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的变化。从微观机制研究黄芪对小鼠肺癌的作用机制,为临床防治提供实验依据。 选题意义选题意义根据中国卫生部肿瘤防治办公室提供的2006年中国肿瘤发病率和十大恶性肿瘤发病率排序显示,肺癌居男性恶性肿瘤发病首位,男女恶性肿瘤死亡率最高的均为肺癌2。2000年世界卫生组织的统计资料表明,每年全球的肺癌新发病例位1.2百万,占全部恶性肿瘤的12.3,死亡1.1百万,占肿瘤全部死因的17.8。更为严重的是,凡是烟草消费大国,其肺癌新发病率乃在不断增长,成为越来越严重的危害人民生命和健康的常见疾病3。原发性肺癌是发达国家的主要肿瘤,以美国为例,1997年全美国肺癌的发生数男性为98300例,女性为79800例,分别是男女肿瘤发病率第二位。1997年因肺癌死亡的人数为160400人,居恶性肿瘤死亡率第1位,占全美国肿瘤死亡病人的294。 中医药在治疗肺癌上有其自己的优势,近几年来应用辨证论治、专方、专药及新药新剂型等方法治疗肺癌均有一定的进展,在稳定病灶、改善症状、提高生存质量、延长生存期等方面都具有一定的疗效和优势。因此研究中医药在肺癌治疗中的作用有其很高的应用价值,能更好的服务于临床中肺癌的治疗。 肺癌属“肺积”、“息责”等范畴,属于祖国医学“咳嗽”、“咯血”、“肺积”,这与肺癌的临床表现有相似之处。中医学认为,肺癌是由于人体正气不足,尤其是肺脾肾虚损,再加上六淫和七情等因素长期作用,导致肺气不足,肺阴亏虚,升降失调,气血瘀滞,内结于肺,形成积块而发生的6。 本研究主要是在建立小鼠肺癌模型,并在此基础上用黄芪对该病进行治疗,通过观察小鼠的一般情况,小鼠瘤组织的重量及抑瘤率、小鼠肺转移灶的影响。采用免疫组化方法,观察黄芪对荷瘤小鼠肿瘤坏死因子及基质金属蛋白酶-9(MMP-9)的变化。从微观机制研究黄芪对小鼠肺癌的作用机制。预期成果不仅可为防治该病证提供新思路和理论依据,指导临床对肺癌的预防、治疗和康复,同时为的深层次机制和研究中药微观作用机制的研究进行资料积累,提供新思路和理论支撑。课题设计课题设计 研究内容与研究方法:研究内容与研究方法: 以小鼠转移肺癌模型为研究对象,采用中西药对比进行治疗,动态观察小鼠的体重改变、抑瘤率的比较、肺组织内基质金属蛋白酶MMP-9肿瘤坏死因子TNF-等细胞因子的变化,从细胞分子水平阐释这些变化,及黄芪和紫杉醇对肺癌的作用的相关性,观察探讨黄芪对肺癌的干预作用的动态变化及时效性,为防治肺癌提供新思路和理论依据。技术路线技术路线 动物实验动物实验 1.肺癌的临床诊断:肺癌的临床诊断必须依据临床表现和各种影像结果进行综合分析,但最后的确诊必须取得细胞学或病理组织学的证据。任何没有病理学或病理组织学证据的诊断,都不能为最后的诊断结果。依据这样的原则,肺癌的诊断可分为肺癌的定位诊断和肺癌的定性诊断两种,所有的影像学诊断法方可认为是定位诊断,而所有以获取细胞学或病理组织学为目的的诊断科认为是定性诊断。定位诊断是基础,定性诊断是关键。2. 肺癌模型建立的方法 (1)肺癌小鼠造模:在本院三级动物实验室中,无菌操作,取肺癌瘤小鼠腹水,稀释至含瘤细胞 2 1010 /L,置冰上,每小鼠右腋皮下接种 0. 2ml,分别给模型组、中药组和西药组接种。接种次日24h后进行药物抑药瘤试验;实验设空白组和模型对照组,中药组和西药组。模型对照组中,每只小鼠腹腔注射等体积生理盐水,中药组中每只小鼠腹灌胃 0.4ml,100mg/ml。西药对照组中。每只小鼠腹腔注射紫杉醇注射液0.2ml,20mg/ml 。每只小鼠每天用药 1 次,连续用药 15天,停药次日处死小鼠,剥离肿瘤,称体重及瘤重,计算抑瘤率。(2)药物干预阶段 造模24h后,空白组、肺癌模型组小鼠不予药物干预,以生理盐水灌胃。中药治疗组小鼠黄芪煎汤灌胃。 药物制备:黄芪25g加8倍水,浸泡半小时,头次煎煮半小时,滤出药渣后加水至药面以上3ml,再煎20分钟。将两次药液混合、过滤,加压浓缩至100%(即每毫升含生药1.0g)的水提剂。 用药方法:将药物按成人日服量换算,计算出小鼠日服量,每日对治疗组小鼠灌服中药煎剂0.4ml/100g体重,对空白组及肺癌模型组小鼠灌服生理盐水0.4ml/100g体重。 连续用药15天,第16天处理所有小鼠。后脱颈处死小鼠,完整剖取接种的瘤块,电子天平称重,按公式:抑瘤率=(空白组平均瘤重-给药组平均瘤重) /空白组平均瘤重100%。小鼠处死后,将整个肺取下。在双盲条件下,计数肺转移瘤灶的数目,按公式:肺转移抑制率=(空白组平均肺转移瘤灶数目-给药组平均肺转移瘤灶数目) /空白组平均肺转移瘤灶数目100%。3.检测指标 (1)整体观测:在实验过程中观察小鼠症状、体重、生存时间、呼吸、被毛情况、食量、饮水量,胸腔,纵膈,胸水。(2)瘤体重测定:小鼠处死后,去肿瘤组织,精密电子天平称重。(3)血生化指标检测:小鼠腹主动脉取血,以ELISA法测定、TNF-的含量,放免法测定血浆中MMP-9的含量(4)瘤组织处理:肿瘤组织用福尔马林液充分固定,常规脱水,二甲苯透明,石蜡包埋,常规切片,HE染色,光镜下观察期组织学变化。肺组织用福尔马林固定12h,进行HE染色,在光学显微镜下观察读片,以进一步确认转移灶的病理性质及特征。4.统计学处理 计量资料以S表示,多组间比较用单因素方差分析,组间两两比较用q检验,计数资料用2检验,P0.05为显著性差异,P0.01为非常显著性差异,均用SAS软件进行统计学处理。技术路线图技术路线图SPF级昆明级小鼠55只随机分组空白组10只模型组15只中药组15只实验全过程观察小鼠的体重、一般情况、生存时间、胸腔、纵隔、 胸水肿瘤接种血生化指标检测:TNF-、MMP-9的蛋白表达肺组织切片:肺病理观察瘤体重的测定14天后停止用药西药组15只24h后开始用药,模型组用生理盐水,中药组用黄芪,西药组用紫杉醇可行性分析可行性分析 1根据内经中“在天为气,在地成形,形气相感而化生万物矣”,“五气入鼻,藏于心肺”,“肺者,气之本。”,“诸气者,皆属于肺。”等论述,肿瘤的病因不外乎内因和外因两个方面。“正气存内,邪不可干”,“邪之所凑,其气必虚”。所以肺癌的发生也不外乎是气虚所致。以此采用以补气为主的黄芪治疗。肺癌的发生与人体的免疫力下降有很大的关系,而现代的药理研究显示黄芪具有提高人体免疫力的作用,故采用黄芪干预肺癌的形成机制是可行的。所以理论上通过肿瘤种植建立转移性肺癌的造模方法,建立肺癌的模型是可行的。 2实验方法:本课题针对中医对肿瘤的病因病机和临床表现的认识,借鉴现代医学实验方法,在建立肺癌小鼠模型的基础上,并对模型进行了病理检查、炎症因子等方面的检测以及方药验证。研究的思路和方法注重中医药理论的指导,对实验结果的分析和相应对策也是从中医学中气的本源出发,立足于病药相应的原则。 3实施保障:我们依托于山东中医药大学细胞生物学实验室,属国家中医药管理局三级重点实验室,为开放实验室,具备完成该项研究的实验条件和所用仪器设备基本能够满足,实验室操作人员经验丰富,具体实验操作熟练,预计可以实现本项目的预期目标。实验中所涉及到的材料和试剂均为商品,在国内能够买到。 本课题特色、预期取得的结果本课题特色、预期取得的结果 创新点:创新点: 1采用中医学和现代医学相比较的治疗的方法,在肺癌采用中医学和现代医学相比较的治疗的方法,在肺癌病因和临床表现的基础上,用直接种植肿瘤的办法建立转病因和临床表现的基础上,用直接种植肿瘤的办法建立转移性肺癌的小鼠模型。移性肺癌的小鼠模型。 2在肺癌小鼠模型建立的基础上用单味中药黄芪和紫杉在肺癌小鼠模型建立的基础上用单味中药黄芪和紫杉醇相比较对该病证进行对照治疗,分析小鼠肺改变,明确醇相比较对该病证进行对照治疗,分析小鼠肺改变,明确肺组织内基质金属蛋白酶肺组织内基质金属蛋白酶MMP-9肿瘤坏死因子肿瘤坏死因子TNF-等细等细胞因子的变化规律,从微观角度阐释该病证在治疗过程中胞因子的变化规律,从微观角度阐释该病证在治疗过程中的动态变化,并初步明确药物的作用机制或作用靶点。的动态变化,并初步明确药物的作用机制或作用靶点。 3该课题观察肺癌小鼠模型在黄芪的干预下的变化,以该课题观察肺癌小鼠模型在黄芪的干预下的变化,以评价模型的稳定性和确定中药干预的最佳时机,具有创新评价模型的稳定性和确定中药干预的最佳时机,具有创新性。性。 国内外研究动态国内外研究动态 1小鼠肺癌模型研究概况 目前常用的小鼠肺癌动物模型有:(1)将肺癌细胞接种于裸鼠或其他免疫缺陷小鼠的皮下。(2)将小鼠的气管分离,经过反复冻融处理,然后将肺癌细胞接种到气管,结扎气管两端后12,再将气管移植到重度复合免疫缺陷小鼠的皮下 。(3)切开胸壁皮肤,将肺癌细胞或肺癌组织直接种植到肺内13-14。此方法有一定的创伤性和死亡率,肺癌细胞生长在肺实质内,但只能使 70%-90%的接种小鼠产生肿瘤,对进行进一步的肺癌研究造成一定的影响。(4)将肺癌细胞直接注入重度复合免疫缺陷型小鼠的气管以建立细支气管内的肺癌模型15。 有学者采用将人类癌组织或肿瘤细胞悬液直接植入支气管的方法,可以很好模拟支气管肺癌的临床特征,但是其技术要求较高,成功率较低8-9。也有人采用外科手术移植方法,同样也是成功率低于 10%10。彭鹏11采用清洁级小鼠C57 BL/6小鼠的腋后线第 6肋间胸腔( 胸腔模型组)或小鼠腋部皮下(皮下模型组)分别移植鼠源性 Lewis肺癌细胞 0.2ml可作为晚期肺癌动物模型。 现在常用的转移性肺癌动物模型有:将肺癌细胞接种于裸鼠或其他免疫缺陷小鼠的皮下。将小鼠的气管分离,经过反复冻融处理 ,然后将肺癌细胞接种到气管,结扎气管两端后,再将气管移植到重度复合免疫缺陷小鼠的皮下21。胸壁皮肤,将肺癌细胞或肺癌组织直接种植到肺脏内22,23。也有经静脉注射或心室内注射等,建立肺癌转移模型。2肺癌的治疗研究概况 肺癌的治疗需依据病人的身体情况及肺癌的类型和分期采取不同的治疗方案。一般而言,非小细胞肺癌采取手术为主的综合治疗,小细胞肺癌则采用以化疗放疗为主的综合治疗3。在化疗方面,临床上分为小细胞肺癌和非小细胞肺癌两种化疗方案。小细胞癌被列入有可能用化疗治愈的疾病,目前的标准化疗方案是CAV(环磷酰胺CTX,阿霉素ADR,长春新碱VCR)和EP(鬼臼乙叉VP-16,顺铂DDP)非小细胞肺癌对化疗不敏感,常用的化疗方案有EP(鬼臼乙叉VP-16,顺铂DDP)NP(去长春花碱NVB, 顺铂DDP)GP(吉西他滨GEM,顺铂和卡铂Carboplatin)TP(紫杉醇TAX,顺铂和卡铂Carboplatin)DP(多西紫杉醇DOP ,顺铂和卡铂Carboplatin)。并且21世纪恶性肿瘤一个重要的治疗方向是分子靶向治疗,目前应用于肺癌的分子靶向药物有表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂的吉非替尼和埃罗替尼。这类药物有一个非常显著的特点是靶人群,如吉非替尼对女性不吸烟的肺腺癌有特别的效果3。 从中医理论上看,正气虚损(气虚或阴虚)容易发生肿瘤。周延峰用消瘤方治疗非小细胞肺癌显示消瘤方能提高机体免疫功能,降低患者血液粘度,抑制肿瘤血管生成,促进肿瘤细胞凋亡,下调突变性P53基因27。陈璐7指出补肾化癖解毒方药对小鼠移植性肺癌及小鼠肺转移均有明显的抑制作用并且补肾化癖解毒方药能提高西药顺铂(DDP)对两者的抑制率。黄健飞28指出极低浓度的丹参注射液对荷瘤小鼠的移植瘤有明显抑制作用,其余浓度的丹参注射液对荷瘤小鼠的移植瘤无明显抑制作用,不同浓度的丹参注射液无明显抑制荷瘤小鼠肺部转移的作用,但低浓度和中浓度的丹

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