代谢工程改造谷氨酸棒杆菌生产甲硫氨酸 附异亮氨酸生产菌的全局代谢网络改造策略.docx

目前，甲硫氨酸的生产方法主要为化学合成法，该方法存在污染大、耗能高 且产物不易分离等诸多不利因素，国内外研究学者及生产者不断寻求环境友好的 微生物发酵法替代此方法生产。但目前微生物发酵法难以实现工业化生产，其主 要原因为微生物体内合成的代谢系统较为复杂，受到严格的调控作用，使得碳流 竞争激烈无法为甲硫氨酸提供足够碳骨架。甲硫氨酸合成途径中的关键酶，受到 副产物赖氨酸及苏氨酸严格反馈抑制及反馈阻遏，影响了甲硫氨酸的合成。需要 改造具有解除末端氨基酸抑制作用的高酶活性突变菌，促使更多的碳流量进入甲 硫氨酸合成途径。本实验室以抗结构类似物北京棒杆菌(Corynebacteriumpekinense) E31为基 础，对天冬氨酸族氨基酸代谢途径的关键酶进行研究，发现了单体酶AK,筛选 出影响AK及HSD活性的多个关键残基位点，构建了多株高酶活性且解除反馈 抑制作用的菌株。谷氨酸棒杆菌具有代谢调控系统简单、遗传背景清晰且无致病性等优点，常 被用来生产天冬氨酸家族氨基酸。对谷氨酸棒杆菌代谢途径进行改造，通过不同 遗传操作手段逐步探究合成途径阻遏关键位点。在对合成途径关键酶AK、HSD 及高丝氨酸乙酰基转移酶(HAT)进行改造的基础上构建串联过表达载体，以增 强各关键酶的表达量，最终通过实时聚合酶链式反应(real-time PCR)、高效液 相色谱分析基因表达情况及氨基酸变化情况，探究碳流阻遏点。并对苏氨酸支路 thrB的底物高丝氨酸结合位点A20进行酸性、碱性、极性和非极性4种类型8种 不同氨基酸定点突变研究，筛选相比于原菌酶活性降低的突变体。以期为规模化 微生物发酵法生产提供理论基础。1过表达连接及real-timePCR分析本研究组已对北京棒杆菌AS 1.299基因组AK及HSD进行克隆、突变和筛 选研究，并对所得突变体进行酶动力学分析，其中AKM372、T379位点是抑制 剂赖氨酸结合口袋的关键残基且高度保守，突变体AKM372I/T379W有效削弱了 赖氨酸与结合口袋附近残基的结合，解除了赖氨酸对AK的反馈抑制作用，突变 后最适PH值减小，耐受范围变广，半衰期有所延长，相比WTAK活性提高36.37 倍。HSD第206位点在家族中高度保守，参与底物的结合，突变成异亮氨酸后 侧链官能团减小，空间位阻降低，更有利于与底物结合，HSDL200D相比于WT HSD活性提高了 17.68倍。基因扩增及载体构建结果如图1所示。图IA中，扩增AK目的基因IysCm为1 274 bp,扩增HSD目的基因homm 为1 338 bp,扩增HAT目的基因metX为1 140 bp。扩增所得长度与目的片段大 小相符，证明各连接目的片段扩增成功。图IB中，穿梭表达载体PECXK99E 大小为7 018 bp,重组载体扩增得到4 000 bp左右IySCm-SD-homm-SD-metX连 接片段，证明过表达载体构建成功。以谷氨酸棒杆菌的DnaE基因作为内参基因，对野生型谷氨酸棒杆菌WTgl 及过表达菌株 WTg 1/PEC-lysCm-SD-homm-SD-metX 中 IysC> hom 和 metX 基因 进行 real-time PCR 分析。结果显示，WTg 1 PEC-lysCm-SD-homm-SD-metX 中 IySC、hom和metX的表达量分别为出发菌株WTgl中对应基因表达量的6.896、 2.378倍和1.659倍，表明AK、HSD及HAT基因串联过量表达有效。2过表达菌株高效液相色谱分析分别对野生型菌株 WTgl 和过表达菌株 WTg 1 PEC-lysCm-SD-homm-SD-metX进行微生物发酵培养，并对72 h发酵上清 液进行反相高效液相色谱检测，结果显示，过表达菌株天冬氨酸、谷氨酸积累量 降低显著，无明显积累；苏氨酸和异亮氨酸产量同步降低；赖氨酸产量相应提高, 甲硫氨酸产量明显提高。过表达AK使得碳源流经三较酸循环后更易流经天冬氨酸下游支路氨基酸 的合成，使得Glu产量由原菌的1.45 g/L减少到0.07gLo real-time PCR分析可 见过表达后HSD转录水平提高到2.378倍，使得天冬氨酸积累量降低至0.09 g/L,碳流量途经中间酶AK及HSD不会产生过多积累，更有利于下游氨基酸的 合成。过表达HAT使苏氨酸由原菌2.93 g/L降至1.61gL,赖氨酸产量变化不大, 甲硫氨酸产量相比原菌提高到2.26倍，达到4.14 g/L。结合real-time PCR及液相色谱氨基酸分析，改造并过表达甲硫氨酸支路关 键酶可有效促进碳流量，减少谷氨酸棒杆菌代谢途径中主要谷氨酸积累，提高了 甲硫氨酸产量。同时发现，经改造后菌株WTg 1 PEC-lysCm-SD-homm-SD-metX 代谢途径中苏氨酸积累量过多，是甲硫氨酸合成途径碳流竞争的第一大氨基酸。 推测如果有效减少苏氨酸产量将更有利于提高甲硫氨酸产量，故本实验试图对苏 氨酸支路首个关键酶thrB进行弱化研究。3thrB突变载体构建本实验从谷氨酸棒杆菌基因组上扩增HSK目的基因thrB进行PET-28a表达 载体连接。进行1%琼脂糖核酸电泳验证，图2A中，基因组扩增thrB靶片段为 1 000 bp,重组载体PET-thrB为6 369 bp,连接载体双酶切验证，两条明显条带 分别于IoOobP及5 00ObP左右，这与目的片段及线性化载体大小相符。图2B 为重组载体突变后PCR扩增电泳，证明质粒在引物作用下实现了大量的复制。 目的片段送于生工生物工程（上海）股份有限公司测序，连接成功。4 thrB突变株酶活性筛选及分析野生型和突变体经非变性银柱纯化后进行12% SDSPAGE验证实验（图3）。 野生型和突变体纯化酶在12%SDS-PAGE的37 kDa左右处均存在单一明亮条带, 表明thrB突变体蛋白在诱导剂IPTG的作用下表达成功，可用于酶动力学测定及 酶学性质表征。本实验对thrB进行酸、碱、极性和非极性4种性质8种氨基酸进行定点突 变，并对突变体进行酶动力学研究及酶学性质表征，结果显示，HSK 20位点丙 氨酸突变成8种不同氨基酸后酶活性多数降低，由各菌株Vmax可以看出其中 突变体thrB-A20H及thrB-A20Y的酶活性降低较为显著，分别为WT-thrB的43% 及39%,最适温度升高至30 和35 oCo碱性氨基酸组氨酸最适PH值增加至 8.5,半衰期延长，更有利于微生物发酵生产蛋氨基酸。突变体thrB-A20Y酶活性降至原菌39%,酶活性降低最为显著，对该突变 位点进行原子间静电力及Pymol图谱分析，见图4。静电势由±74.552 kJ/mol变 为±74.573 kJ/mol。酪氨酸侧链较大，与底物高丝氨酸的空间位阻增大距离变远, 导致高丝氨酸不能很好地进入底物结合口袋，影响酶与底物结合效率，使酶活性 降低。结论本实验通过在谷氨酸棒杆菌内串联表达合成途径关键酶基因LySCm、homm 和metX,获得菌株WTgl/PEC-IySCm-SD-homm-SD-metX,有效增加了合成途径 的碳流量，使积累量大幅度提高，达到4.14 g/L,实现了产量的提高。实验对苏 氨酸支路关键酶thrB基因进行定点突变研窕，获得多株酶活性降低突变株，其 中thrB-A20Y活性降至原菌39%,为微生物体内弱化苏氨酸支路、增强甲硫氨 酸积累提供理论基础。异亮氨酸生产菌的全局代谢网络改造策略加, WM. MW、I 2 MLotaudn【摘要】L-异亮氨酸是一种支链氨基酸，也是人体必需氨基酸，可作为食品 营养补充剂、药物和饲料添加剂。本文主要综述了谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌合成 L-异亮氨酸的调控机制和全局代谢网络改造策略现状，重点阐述基因工程技术在 L-异亮氨酸产生菌改造中的应用。【关键词】L-异亮氨酸基因工程改造策略Abstract L-isoleucine is a branched-chain amino acid and an essential amino acid for humans. It can be used as a food nutrition supplement, medicine and feed additive. This article mainly reviews the control mechanism of L-isoleucine synthesis by Corynebacterium glutamicum and Escherichia coli and the status of global metabolic network transformation strategies, and focuses on the application of genetic engineering technology in the transformation of L-isoleucine producing bacteria.Keywords L-isoleucine genetic engineering modification strategy异亮氨酸是一种支链氨基酸，也是人体必需氨基酸，在食品领域主要用于食 品添加剂，在医药领域主要用于氨基酸输液成分之一，而且它的需求量在逐年增 加口。传统意义上的L-异亮氨酸生产菌株大多数是由野生菌株经过物理或化学 的方法经过多轮诱变筛选获得。研究发现，基因突变往往充满着很多不确定性，而且在高通量筛选菌种时工 作量较大，此外反复使用同一种诱变因子可能会出现钝化现象并且引起微生物的 回复突变，使诱变育种变得不易控制2。基因工程技术的发展为L.异亮氨酸高产菌株的筛选提供了全新选择，该技 术主要基于目前研究人员对L.异亮氨酸合成途径和调控机制的深入了解，定向 改造有利于L-异亮氨酸合成的某些基因或其代谢途径，使碳源最大化流向L-异 亮氨酸同时解除L-异亮氨酸的自身反馈抑制，因此利用这种方法获得的L-异亮 氨酸高产菌株产量高且遗传性状稳定。IL-异亮氨酸的合成途径与调控机制谷氨酸棒杆菌是L-异亮氨酸生产菌的常用菌株，其产L异亮氨酸的生物合 成途径、调控机制及其运输系统如图1所示。L天冬氨酸首先经过L-天冬氨酸 激酶（AK）、天冬氨酸半醛脱氢酶（ASD）、高丝氨酸脱氢酶（HDH）、高丝氨 酸激酶（HSK）和苏氨酸合酶（TS）催化的五步酶学反应转化生成L-苏氨酸3。 AK由IySC基因编码合成，其活性受到L-苏氨酸和L-赖氨酸协同反馈抑制，是 L-异亮氨酸合成途径上的第一个关键酶;HDH由horn基因编码，是L-异亮氨酸 合成途径上的第二个关键酶，调控HDH催化的酶反应是控制碳流流向支路的关 键之处，其表达受到L-甲硫氨酸的轻微反馈阻遏;HSK是由thrB基因编码，可将 高丝氨酸磷酸化形成磷酸高丝氨酸，可控制流向苏氨酸合成的碳流，其酶活性受 到L-甲硫氨酸和L-苏氨酸的反馈抑制，是L-异亮氨酸合成途径上的第三个关键 酶;苏氨酸脱水酶（TD）对苏氨酸的脱氨基，可控制L-苏氨酸到L-异亮氨酸的碳 流，是L-异亮氨酸合成途径上的第四个关键酶;乙酰羟基氨酸合酶（AHAS）催 化丙酮酸和2-酮基丁酸生成乙酰羟丁酸，由于该酶还可以催化合成L-缴氨酸和 L.亮氨酸，所以其决定了不同产物的碳流，是L-异亮氨酸合成途径的第五个关 键酶4-5。大肠杆菌是另一个常用的L-异亮氨酸生产菌株，它的L-异亮氨酸生物合成 途径及调控机制如图2所示，与谷氨酸棒杆菌略有区别6。L-天冬氨酸先经五 步反应合成L-苏氨酸，L-苏氨酸再经五步反应后生成L-异亮氨酸，与谷氨酸棒 杆菌不同的是AK有三个同工酶为AK I > H和I,分别由thrA、metL和tysc 编码。AKI . 和In具有不同的调控机制，在基因