常用的蛋白分析技术-WB实验操作步骤详解.docx

常用的蛋白分析技术TB实验操作步骤详解蛋白样品的提取及蛋白含量的检测蛋白样品的好坏，直接决定了能否做出来蛋白条带，所以蛋白样品的提取需严格按照试剂盒说明书进行。凝胶配置凝胶选择：请根据蛋白分子量的大小，选择合适浓度的分离胶,可参考凝胶配置试剂盒中的说明书，或者参考文献。配胶的APS需要在4。的冰箱中保存。注意，配胶的时候，胶一定一定要混匀。配胶的试剂中，APS与TEMED是促凝剂，所以在加促凝剂之前，需先把其他组分混匀。分离胶浓度线性分离范围6%50-150kDa8%30-90kDa10%20-80kDa12%12-60kDa15%10-40kDa操作：将配置好的分离胶沿着玻璃板一侧缓慢打入玻璃板中，这个时候不用担心打入气泡。灌入合适量的分离胶之后，加入适当剂量的ddWater或者无水乙醇封胶。（加入封胶试剂量没有规定，盖住整个分离胶胶面即可）上样Marker孔加入5-10L,其余蛋白总上样量3050g.电泳接上电源后，先用80V恒压电泳至澳酚蓝指示剂到浓缩胶与分离胶交界处，成线状，改为恒压120V直至澳酚蓝电泳到凝胶底部，此过程约用时1.5ho小贴士：根据实验要求可以进行适当调整，蛋白条带较大时，可延长电泳时间；条带较小时，参照预染Marker条带决定电泳时间。电泳开始的时候，开制冰机制冰，为后面的转膜做准备。转膜（湿转）操作步骤1 .取出凝胶，根据Marker切下目的条带，用蒸播水冲洗，并裁剪与SDS-PAGE凝胶相同大小的PVDF膜，滤纸应与纤维垫相同大小；2 .PVDF膜用甲醇浸泡InIin后,和滤纸一同浸泡于电转缓冲液中；3 .按照黑色板-纤维垫-滤纸-凝胶-PVDF膜-滤纸-纤维垫-白色板依次放好，夹紧板后放入湿转电转槽内，黑色板的一面对黑色负极;4 .在转膜槽中加满电转液，开始转膜。（转膜槽置于水中，并放入冰冻结块的冰袋，尽量多放几个冰袋，保证电转一直处于低温下进行。若转膜时间较长，中途温度升高，可更换冰袋）蛋白大小kDa电流/mA时间min<101503010-201505020-301507030-451509045-7015012080-100200120100-140200150小贴士：蛋白大小大于14OkD条件下，先在电流20OmA情况下转膜12Omin,然后将电流提高到250mA,继续转膜30min°封闭和抗体的孵育漂洗PVDF膜置于回旋振荡器上漂洗InIin,重复漂洗2-3次。封闭用含5%脱脂奶粉的TBST（封闭液）浸泡PVDF膜，室温摇床封闭2h0磷酸化蛋白用5%的BSA封闭2h。一抗孵育用含5湖兑脂奶粉的TBST（检测磷酸化蛋白用含5%BSA的TBST）稀释相应的一抗，使PVDF膜浸泡于一抗孵育液中，4孵育过夜。洗涤TBST充分洗涤PVDF膜3次，15min次。二抗孵育用稀释一抗体系相同的稀释液稀释HRP标记二抗，使PVDF膜浸泡于二抗孵育液中，室温孵育lh。洗涤TBST充分洗涤PVDF膜4次，15min次。显色曝光ECL发光液A液与B液1：1混合（现配现用）；PVDF膜从TBST洗液中取出后，用滤纸吸干水分（一般用干净镶子夹住PVDF膜，让膜的一角接触滤纸）；将PVDF放置于成像仪上，均匀滴加ECL工作液，排出气泡，开始曝光。aveSUCCeSSJ6092¾375050,0020-l4633.jpg机器曝光小贴士：先选择自动曝光进行曝光。同一张膜上未曝光出条带的,可选择手动曝光，加长时间再次曝光。