基孔肯雅热实验室检测方案.docx

基孔肯雅热实验室检测方案一、标本的采集（一）患者标本的采集。急性期血清：发病1周内，无菌静脉采集非抗凝血5ml。恢复期血清：发病后2至3周或以上，无菌静脉采集非抗凝血5mlo（二）伊蚊标本的采集。在本病暴发或流行期间，采集疫点的伊蚊成蚊和幼虫，用于病原学检测。二、标本的保存与运输血液标本采集后，在4。C条件下尽快运送至实验室进行血清分离并保存。血清标本可置于-20。C冰箱短期保存，长期保存须置-70。C以下。标本运输按照卫生部人间传染的病原微生物名录的规定执行。三、检测方法常用检测方法主要有3种：血清学检测、核酸检测和病毒分离。一般情况下，病毒分离与核酸检测宜采用发病后1周内的血清；IgM抗体检测宜采用发病4天后的血清，IgG抗体的检测宜采用发病1周后的血清。（一）血清学检测方法。1 .特异性IgM检测。采用的方法有：捕获ELlSA法（MacELISA）、间接ELISA法、免疫荧光法和免疫层析法等。2 .特异性IgG检测。采用的方法有：间接ELISA法、免疫荧光法和免疫层析法等。3 .意义(1) IgM阳性结果，表明患者新近CHIKV感染，用于基孔肯雅热早期诊断。(2) IgG阳性结果，表明曾受到CHIKV感染；恢复期血清抗体滴度比急性期抗体滴度有4倍或4倍以上升高则可确诊。(二)病原学检测方法。1 .基孔肯雅病毒核酸检测。一般发病后7日内在多数患者的血清中可检测到病毒核酸。冻存伊蚊标本也可进行基孔肯雅病毒核酸检测。可采用RT-PCR和Real-timeR-PCR等核酸扩增的方法检测。2 .病毒分离鉴定。常用Vero.C6/36等敏感细胞系开展病毒分离，分离物可以免疫荧光法或核酸检测进行鉴定。3 .意义。患者血清中分离到基孔肯雅热病毒和/或检测到病毒核酸后，可确诊基孔肯雅热病毒感染。基孔肯雅热实验室检测方法基孔肯雅热的实验室检测方法主要有以下几种：病原学检测：核酸检测：一般发病后7天内血液样本病毒核酸检出率较高，常采用实时荧光RT-PCR基于核酸扩增的方法进行检测，可用于早期诊断。对于核酸检测阳性样本可开展病毒基因序列测定和分析，本地传播疫情样本选择应兼顾不同时段、不同地区样本，优先选取首例本地病例样本。病毒培养分离：一般发病后5天内血液样本病毒培养分离率较高，通常将样本接种至哺乳动物细胞（Vero、bhk21）中进行分离与培养，待其出现病变特征后，采用抗原或核酸检测手段鉴定病毒种类。抗原检测：常用双抗体夹心ELISA法或免疫层析法进行抗原检测，一般适用于发病后5天以内血液样本，检出阳性可用于早期诊断。基因组序列分析：采用一代Sanger法或扩增子技术进行病毒E2和El蛋白编码基因序列或全基因组测序，测序技术经质控合格后，方可用于后续生物信息分析。二代测序平台覆盖深度应不低于IOx,三代测序平台覆盖深度应不低于50x,全基因组测序覆盖度应不低于98%o血清学检测：特异性IgM抗体：采用ELlSA、免疫层析等方法检测，是辅助诊断基孔肯雅热急性期或近期感染的重要指标。特异性IgG抗体：采用ELISA、免疫荧光（IFA）、免疫层析等方法检测。患者恢复期血清IgG抗体阳转或滴度较急性期呈4倍及以上升高可以确诊。中和抗体：采用空斑减少中和实验、微量中和实验等方法检测，可用于分型。患者恢复期血清中和抗体阳转或滴度较急性期呈4倍及以上升高可以确诊。