化妆品防腐挑战测试评估技术指南.docx

化妆品防腐挑战测试评估技术指南目录1 .范围12 .术语和定义13 .设备和材料14 .培养基和试剂25 .测试菌株36 .测试方法47 .说明11M寸录A121.范围本指南规定了化妆品防腐效能的评价方法。本指南适用于化妆品防腐体系效能评价。2.术语和定义2.1防腐效能评价试验将一定量的微生物人工污染到化妆品中，模拟化妆品可能出现的污染情况，每隔一定时间检测其中的存活菌量，根据存活菌量的变化评价化妆品防腐体系效能的试验方法。2.2中和剂可添加至化妆品和微生物混和物中，消除化妆品中抑菌或杀菌成分对微生物抑制或杀灭作用的试剂。3.设备和材料3.1A2型生物安全柜。3.2高压蒸汽灭菌器。3.3天平：感量为O.1g。3.4恒温培养箱：36+1、28+2、25+2o3.5均质器。3.6无菌吸管：ImL（具0.OlmL刻度）、IomL（具0ImL刻度）或微量移液器及吸头。3.7显微镜。3.8酸度计。3.9涡旋混匀器。3.10灭菌平皿：直径90mm。3.11无菌玻璃棉。4.培养基和试剂4.10.85%生理盐水。4.2卵磷脂吐温80营养琼脂培养基，见附录A.1o4.3虎红（孟加拉红）培养基，见附录A.2o4.4含0.05%（vv）聚山梨酯8O的生理盐水，见附录A.3o4.5胰酪大豆陈琼脂培养基(TSA),见附录A.4o4.6沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA),见附录A.5o4.7SCDLP液体培养基，见附录A.6。4.8EugonLT100肉汤，见附录A.7。4.9D/E中和肉汤，见附录A.8o4.10改良Letheen肉汤，见附录A.9o5.测试菌株5. 1细菌金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003大肠埃希氏菌CMCC(B)44102铜绿假单胞菌CMCC(B)101046. 2真菌黑曲霉CMCC(F)98003白色念珠菌CMCC(F)98001在进行化妆品防腐效能评价试验时，可根据需要增加其他相关细菌或真菌作为测试菌株。7. 测试方法7.1 供试品微生物检测取不少于2份包装完好的供试化妆品样品，依据化妆品安全技术规范第五章微生物检验方法中微生物检验方法总则、菌落总数、霉菌和酵母菌检验方法对样品进行检测，检测结果应符合化妆品安全技术规范中的限值规定。供试品微生物检测的结果记作Nf06. 2微生物悬液制备6.1.1 细菌悬液制备用接种环从菌种保存管中（或试管斜面上）取适量菌体，分区划线接种于TSA平板，36±1培养18h24h。用接种环取第1代培养物，分区划线接种于TSA平板，36°C±1°C培养18h24ho挑取上述第2代培养物中典型菌落，分区划线接种于TSA平板，36°C±1°C培养18h24h,即为第3代培养物。用无菌棉签取菌苔加入无菌生理盐水中，涡旋混匀。用无菌生理盐水将其稀释成约IO,CFU/mL1。8CFU/mL的菌悬液。制备好的菌悬液应在2h内使用，或在28保存不超过24h。6.1.2 白色念珠菌菌悬液的制备用接种环从菌种保存管中(或试管斜面上)取适量菌体，分区划线接种于SDA平板，28±2培养48h72h。用接种环取第1代培养物，分区划线接种于SDA平板，28°C±2°C培养48h72ho挑取上述第2代培养物中典型菌落，分区划线接种于SDA平板，28°C±2°C培养48h72h,即为第3代培养物。用无菌棉签取菌苔加入无菌生理盐水中，涡旋混匀。用无菌生理盐水将其稀释成约1。6CFU/mLIO?CFU/mL的菌悬液。制备好的菌悬液应在2h内使用，或在28保存不超过24h。6.1.3 黑曲霉抱子悬液的制备用接种环从菌种保存管中(或试管斜面上)取适量的菌体，分区划线接种于SDA平板上，28°C±2°C培养3d7d。用无菌棉签取菌苔加入含0.05%(vv)聚山梨酯80无菌生理盐水中，制备泡子悬液，轻轻振摇Imin后，用无菌玻璃棉过滤除去菌丝。用含0.05%(vv)聚山梨酯80无菌生理盐水将其稀释成约1。6CFU/mLICTCFU/mL的抱子悬液。制备好的抱子悬液应当天使用或在28保存不超过7d,使用前混合均匀，并在显微镜下观察是否有抱子出芽，若有抱子出芽，则弃之不用。表1测试菌株培养条件培养基培养温度培养时间培养基培养温度培养时间金黄色葡萄球菌CMeC(B)26003TSA36°C+C18h24h大肠埃希氏菌CMCC(B)44102TSA36°C+C18h24h铜绿假单胞菌CMCC(B)10104TSA36°C+C18h24h黑曲霉CMCC(F)98003SDA28+23d7d白色念珠菌CMCC(F)98001SDA28+248h72h注：实验室增加的其他测试菌株可参考以上细菌及真菌的培养温度和时间进行培养。使用的工作菌株培养物传代不可超过5次。6.3 中和剂效果验证试验6.3.1 工作菌悬液制备用稀释液将上述菌悬液(或使用商业冻干菌株)10倍系列稀释至1。3CFUmL,用于中和剂效果验证。6.3.2 试验分组每种测试菌株的中和剂效果验证试验应分别进行。试验分为以下三组，按如下方法进行染菌。试验组：将lg(mL)供试品加入9mL中和剂中，混匀，室温放置30min±15min,使其充分作用；中和剂对照组：将1mL稀释液加入9mL中和剂中，混匀，室温放置30min±15min;菌液对照组：IOmL稀释液。在以上三组中，分别加入6.3.1中制备的工作菌悬液各ImLo6.3.3 培养与计数分别对试验组、中和剂对照组和菌液对照组进行平板计数，每组接种两个平皿，按照表1的要求进行培养。各组计数结果取平均值，试验组计数结果记作Nvf,中和剂对照组计数结果记作Nvn,菌液对照组计数结果记作Nv,6.1中供试品微生物检测的结果记作Nf06.3.4 结果判定当Nvn/Nv接近（如0.5SNVn/NvS2）,并且（NVf-Nf）/Nvn0.5时，判定中和剂有良好的中和效果，通过中和效果验证。若供试品测试未能通过中和效果验证，可以更换中和剂或增加中和剂用量。可选用的中和剂请参考附录A.6A.9,或根据需求选择适宜的中和剂进行中和效果验证。6.4 供试品防腐挑战测试6.4.1 供试品染菌防腐挑战试验采用单一菌种染菌的测试方式，即分别用每种测试菌株的菌悬液人工污染供试品，每隔一定时间检测其中的存活菌量，根据存活菌量的变化判断化妆品防腐体系效能。分别取6.2中制备的菌液，加入装有不少于20g(mL)供试品原包装中，或加入装有20g(mL)供试品的适宜容器中，充分混匀，菌液的接种体积应不超过供试品体积的1%。细菌的染菌浓度为1。5CFUg(mL)1。6CFUg(mL),真菌的染菌浓度为IO4CFUg(mL)-105CFUg(mL)。染菌后的样品放置于25±1培养箱中，分别在7、14和28天检测其中的存活菌量，分别计作Nx(X=7,14,28)(详见6.4.4中对时间点的规定)。6.4.2 计数方法放置至规定时间后，取IgCmD染菌样品，加入9mL经6.3验证有效的中和剂中(样品的稀释倍数应参考6.3中和剂中和样品的稀释倍数，并与其保持一致，保证样品中的抑菌成分可以被有效中和)，充分混匀。室温中和30min±15min后，吸取2mL样液，分别注入到两个灭菌平皿内，每皿ImL。将45°C50°C的相应培养基(详见表1)15mL20mL倾注到平皿内，充分混匀，凝固后按要求进行倒置培养、计数。如平板上预期生长菌落数较多，可进行10倍系列稀释，选择适宜的稀释度进行平板计数，或选用平板涂布法进行上述试验。计数结果计算方法和报告方式可参考化妆品安全技术规范第五章2.菌落总数检验方法和6.霉菌和酵母菌检验方法。6.4.3 计算方法化妆品防腐效能评价用供试品中存活菌量常用对数减少值(RX)作为评价指标，计算方式见式(1)：Rx=IgN0-IgNx(1)式中：No供试品初始染菌量。Nx不同检测时间，供试品中存活菌量。6.4.4 结果判定表2化妆品防腐挑战结果判定原则不同取样时间供试品中存活菌量常用对数减少值（RX=lgN0-lgNxy细菌白色念珠菌黑曲霉T7T14T28T7T14T28T14T28判定标准A33且Nlb3且Nl11且Nl1且Nl0c1且Nl判定标准B_d33且Nl-11且Nl>0且Nla.在防腐效能测试中，可接受偏差范围为O5log；b.NI：与上一时间点的计数结果相比，差异未超过0.5log；cNx与初始染菌量NO相比，差异未超过0.5log时，Rx=O;d.表示无需进行测试。一判定标准A,适用于不考虑其它控制因素条件下，产品配方能有效防止可能会对消费者构成潜在安全风险微生物增殖的产品。一判定标准B,适用于除产品组方因素外，对微生物污染采取了经风险评估有效的其他控制方式的产品，如采用特定包装等手段控制微生物污染。7.说明化妆品注册人、备案人可以依据国家标准、技术规范、行业标准、国际标准、本技术指南或自建方法开展相关研究，并在安全评估报告中提交相关测试或者评估结论。（规范性附录）培养基和试剂A.1卵磷脂吐温80营养琼脂培养基成分：蛋白陈20.0g牛肉膏3.0g氯化钠5.0g琼脂15.0g卵磷脂1.0g吐温8070g水100OmL制法：先将卵磷脂加到少量蒸储水中，加热溶解，加入吐温80,将其他成分（除琼脂外）加到其余的蒸储水中，溶解。加入已溶解的卵磷脂、吐温80,混匀，必要时调节pH,加入琼脂，121°C高压灭菌20min°灭菌后的培养基在25的PH值为7.2±0.2oA.2虎红（孟加拉红）培养基成分：蛋白陈5.0g葡萄糖10.0g磷酸二氢钾1.0g硫酸镁（含7H2O）0.5g琼脂20.0g1/3000虎红溶液100mL（四氯四碘荧光素）水100OmL氯霉素100mg制法：将各成分(除虎红和氯霉素外)加入蒸储水或纯化水中，搅拌溶解后，加入虎红溶液，必要时调节pHo121高压灭菌20min,另用少量乙醇溶解氯霉素，溶解过滤后加入培养基中，若无氯霉素，使用时每100omL加链霉素30mgo灭菌后的培养基在25的PH值为7.2±0.2oA.3含0.05%(vv)聚山梨酯80的生理盐水成分：氯化钠8.5g聚山梨酯800.5g水100OrnL制法：将各成分加入蒸储水或纯化水中，搅拌后加热溶解，必要时调节pH。121高压灭菌20min,灭菌后的培养基在25的PH值为7.0±0.2oA.4胰酪大豆陈琼脂培养基(TSA)成分：胰酪豚15.0g大豆蛋白陈5.0g氯化钠5.0g琼脂15.0g水100OrnL制法：将各成分加入蒸谯水或纯化水中，搅拌后加热溶解，必要时调节pH。121°C高压灭菌15min,灭菌后的培养基在25的PH值为7.3±0.2oA.5沙氏葡萄糖琼脂培养基(SDA)成分：蛋白陈5.0g酪蛋白陈5.0g葡萄糖40.0g琼脂15.0g水100OrnL制法：将各成分加入蒸偶水或纯化水中，搅拌后加