凝胶过滤法分离蛋白质.docx
凝胶过滤法分离蛋白质实验原理ONE:分子篇层析mo1.ecu1.ar-sievechromatography凝胶过滋层析ge1.-fi1.trationchromatography分子排阻层析mo1.ecu1.arexc1.usionchromatography凝胶具有网状结构，小分子物质能进入其内部，而大分子物质却被排除在外部.当混合溶液过凝胶过滤层析柱时，溶液中的物质按不同分子量筛分开.TW0:凝胶过源介质不溶于水，在水中有较大膨胀度和较好的分子筛功能，多孔的网状结构.常用凝胶：葡聚糖凝胶(Sephadex)和琼脂糖凝胶(Sepharose),聚丙烯酰胺凝胶(Bio-ge1.P).凝胶因交联度不同,孑1.不同,交联度越大,孑U磁小。蛋白质分子直径>凝胶孔径时，被排阻在外，小于孔径者则进入凝胶.THREE:交联葡聚德凝胶(Sephadex)葡聚糖和3-氯-1,2环氧丙烷以品犍相互交联形成.按交联度大小分8种型号，G值代表不同交联度。SephadexG-10,15,25,50,75,100,150,200数字表示每克干胶膨胀时吸水量的10倍。SephadexG-25代表每克干胶膨胀时可以吸水2.5克.G值越小，交联度越大,网孑融小，吸水膨胀越小，只能分图相对分子量小的物质；G值越大,交联度越小，网孔越大，吸水膨胀越大，可以分离相对分子量大的物质；分离范圉Mr（肽和球蛋白）SephadexG-251000-5000SephadexG-501500-30000SephadexG-753000-70000补充说明：凝胶过油层析特点水设备简单，操作方便*分离条件温和，样品回收率高（100%）水实验重复性好除盐：Q选择孑1.小，交联度大的凝胶.QSephadexG-25全排出的最小分子量为5000QSephadexG-50全排出的最小分子量为30000（除盐的蛋白质分子量必须大于30000,消除凝胶对蛋白质的滞留作用.）Q当分子量未知时，选择SephadexG-25Q洗脱时，大分子受阻小最先流出，小分子受阻大而最后流出，结果使大小不同的物质分离。用葡萄糖凝胶G-25或G-50过住的办法除盐，所用的时间就比较短.Q用于分离及测定样品分子量：标准分子量样品，IogMW对洗脱体积作图实验器材与试剂器材：每组1×20cm层析柱、蝴份自动收集器、泵（两组一台）、铁架台（带蝴蝶夹）、坡璃棒、SOOmI烧杯（装柱用）1个、100m1.烧杯2个、一次性滴管、多余的垫圈。试剂：葡聚糖凝胶Sephadex-50:蛋白质工作范围：15OO-30000,得水值=5.0gg干胶，最小溶胀时间：室温6h,沸水浴2h.取Sephadex-5015g,力口500力口50Om1.蒸储水室温溶胀1天（或沸水中溶胀1h）,待溶胀平衡后，顷去上清液，包括细颗粒，然后再放些蒸谄水搅乱，静宜使凝胶下沉，再倾去上清液，至无细颗粒为止（泡久一些再使用，可用水浴锅加热）.：6mgm1.蓝色葡聚糖溶液：蓝色葡聚糖18Omg-30m1.。:30mgm1.细胞色素C溶液（MW=12327）:240mg-8m1.细胞色索Ce：2mg/m1.重馅酸押溶液（MW=294.18）:重铝酸钾60mg-30m1.、溶液各取6滴于1m1.离心管中混匀，每组1份。置冰箱中保存，或临时配制.PH8.2洗脱液：配制2mo1.1.的氯化钠水溶液500m1.;配制2mo1.1.的碳酸钠水溶液500m1.;配制10mmO1./1.的抗化钠水溶液11.（用2mo1.1.的氯化钠水溶液1:200稀释），然后用2mo1.1.的碳酸钠（此浓度调Ph过高，可适当稀释后使用）调PH至8.2.实船操作1.凝胶溶胀：取SephadexG-5015g,力口500m1.蒸憎水室温溶胀一天（或沸水浴中溶胀1h）.待溶胀平衡后，倾去上层清液，包括细颗粒，然后再放些蒸饲水搅乱，静置使凝胶下沉，再倾去上层清液，至无细颗粒为止.不能剧烈搅拌，严禁用磁力搅拌器，否则易破碎，使流速下降和分离效果降低.2、装柱：取1×20cm层析柱，底部出口套上乳胶塑料管，向层析柱内加蒸镭水的走层析柱下过漉层死体积和接口处的气泡）,在蒸储水高度约占层析柱高1/3时，关闭下端出口（用掾皮筋）.自顶部缓缓加入Sephadex-50忌液,待底部凝胶沉积1-2cm时，打开下端出口，凝胶加至离层析柱顶部约3cm.用蒸镭水过柱几遍，以稳定床体积（不能让凝胶表面露出水面。装柱时，凝胶柱内若有气泡或分离断层，可用玻棒搅动消除或重新装柱，装柱结束后凝胶表面应平整。3、加样:取4mgm1.蓝色葡聚糖溶液、6mgm1.细胞色素C溶液、2mgm1.重珞酸钾溶液各6滴混合上柱样品.打开下端出口，使表面的蒸镯水流出，直至恰好与表面相平（不可使床面干掉），关闭下端出口，用滴管将上述样品缓缓地加到床表面（不要使平整的床表面搅动）.打开下端出口，让样品进入床内，直至样品全部进凝胶柱，关闭下端出口.滴加蒸福水使凝胶柱上端有2cm水柱.4、洗脱和收集:打开下端出口，让柱内液体缓慢流出，调节蝶动泵流速，流速033m1.min（3分钟1m1.,不能让凝胶表面露出水面）.设首部分收集器参数，每3分钟收集1管。取小试管20支，每管收集1m1.,观察三种颜色出现的管号，用+,-或5,4,3,2,1,0数字表示颜色深浅。凝胶再生和保存：Sephadex,Sepharose多糖，微生物-水解糖苗键各种凝胶悬浮液加防腐剂或灭菌-一冰箱（冰点以上）保存数月防腐剂：0.02%叠氮化钠高压蒸汽灭菌：0.1MPa,30分钟长期保存：Sephadex,Sepharose多糖，微生物一一酶水解糖苜键各种凝胶悬浮液加防腐剂或灭蕾一冰箱（冰点以上）保存数月防腐剂：0.02%叠锐化钠高压蒸汽灭菌：0.1MPa,30分钟注意事项接头不漏气，连接用的4浮1.胶管不要有破损，否则造成漏气、漏液装柱要均匀,不要过松也不要过紧，流速不宜过快，避免压紧凝胶.但也不要过慢，使柱装得太松，导致层析过程中，凝胶床高度下降.始终保持柱内液面高于凝胶表面，否则水分挥发，凝胶变干.绢布、塑料密封圈
