先天性输精管缺如患者临床特征及CFTR基因突变筛查.docx

先天性输精管缺如患者临床特征及CFTR基因突变筛查安排于不同区域而达到分别的目的，如电泳、离心等。在实际工作中，往往须要综合运用几种方法。不论运用何种方法，必需遵循以下原则：保证DNA一级结构的完整性：解除其他分子的污染。经过细胞破裂和溶剂萃取，得到的是DNA粗提液。DNA粗提液可以依据一些标准(如蛋白质的含量、糖类的含量等)选择是否须要进行纯化。目前，DNA纯化可以运用生物公司供应的商业化核酸纯化试剂盒，也可以运用传统的方法进行纯化，如有机溶剂抽提、沉淀、梯度离心法、用酶温柔消化杂质法等。对于DNA的纯化应达到以下三点要求：DA样品中不应存在对每有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离了；其他生物大分子如蛋白质、多糖和脂类分子的污染应降到最低程度：解除其它核酸分子(如RNA分子)的污染。聚合酶链式反应(PO1.ymeraSeChainReaction,PCR)要对目的基因或是目的DNA片段进行是否存在突变的分析，须要通过PCR反应来扩增目的基因或目的DNA片段。PCR是一种在体外模拟自然DNA复制过程，快速扩增特异性DNA序列的技术，藉由加入适当的两段寡核甘酸作为反应的引物(Primer)、四种脱氧核甘三磷酸(dNTP).DNA聚合酶等反应物,利用机器反复的升温降温，将上面提取到的基因组DNA的目标基因或DNA片段精确扩增。(I)PCR步骤PCR技术的基本原理类似于DNA的自然熨制过程，其特异性依匏于与靶序列两端互补的寡核甘酸引物。PCR由变性-退火-延长三个基本反应步骤构成：模板DNA的变性：双链DNA模板的变性温度时布.其G÷C含量确定的，在应用TaqDNA聚合酶进行PCR反应的时候，模板DNA一般加热至94eC肯定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解高，成为单链，以便与引物结合，为下轮反应作打算：模板DNA与引物的退火(夏性)：退火是使引物和模板DNA复性。其退火温度一般比理论计弊的引物和模板的熔解温度低3-5'C的条件下进行26：引物的延长：DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合前的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的链。重复循环变性-退火-延长三过程，就可获得更多的半保留复制链，而且这种新链乂可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2-3分钟，1-3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍飞(2)PCR反应条件模板:模板对PCR的影响主要有两个方面：（八）模板的纯度：一般来说，PCR对模板纯度的要求不高，但在模板DNA溶液中,不能有蛋白质、核酸酶、尿素、十二烷基磺酸钠、EDTA等影响扩增反应的物质存在；(b)模板DNA的量：模板DNA.