中药新配方景丹胰敏剂治疗代谢综合征的方剂研究.docx

中药新配方景丹胰敏剂治疗代谢综合征的方剂探讨中药新配方景丹胰敏剂治疗代谢综合征的方剂探讨摘要以传统中医药学理论为基础，结合现代药物探讨的体外分了作用靶点和体内动物试验，探究治疗代谢综合征的中药复方景丹胰敏剂(TD)的药材选择、复方的组成、配比及其有效剂量。应用高脂饲料诱导的胰岛素反抗合并高胆固醇血症的IRF小鼠模型，以葡萄穗耐量(GTT)、胰岛素耐量(117)等指标评价机体对胰岛素的敏感性：以生化方法检测血糖和总胆固醇(TC)水平、以及分子靶点-葡萄糖昔酶、蛋白酪氨酸磷酸醇IB(PTP1.B)和谷氨酰胺:6-磷酸果糖酰胺基转移酶(GFAT)的活性。分别依据样品抑制PTP1.B和-葡萄糖昔酶活性、调整IRF小鼠血TC水平和抑制GFAT活性作用，选择西藏大花红景天的H13部位（三）、蛹虫草的Y12部位(y)和大黄的D部位(d)作为复方的组分：确定JD各组分治疗IRF小鼠代谢综合征具有协同作用：依据1.8(27)正交试验设计和分别抑制分子靶点PTPIB和-葡萄糖背酶作用，确定JD各成分的最佳配比：依据JD对IRF小鼠的糖耐量低减和高胆固醇血症的治疗作用，确定JD的口服有效剂量。总之，配方JD由红景天、蛹虫草、大黄按比例20：1：1组成；其治疗代谢综合征的口服有效剂量为200mg?kg1.：其主要作用机制是抑制分子靶点PTP1.B和-葡萄糖甘酶。其中，红景天补气清肺，化淤养心，为君药；蛹虫草味甘性温,补肺气，益肾精，化痰浊，强腰膝，与红景天配伍，增加补益肺肾之功，为臣药：大黄泻热解毒，逐瘀通经，与君臣药物相配，发挥其祛逐邪毒淤滞之功，为佐使药。此三药配伍，共凑补气、益精、清热、活血、化痰之功效，用以治疗代谢综合征。关键词方剂探讨：胰岛素反抗：高胆固醉血症；蛋白酪氨酸磷酸酶1B；-葡萄糖昔函代谢综合征是以胰岛素反抗、2型轴尿病/菊萄糖耐量低减、血脂紊乱、肥胖和高血压等为主要特征的一组症候群，属中医消渴症而并发眩晕、胸痹、肥胖、痹痛等证候,其基本病机为正虚邪实。正虚主要是气虚精亏，邪实主要是热、瘀、痰，其次是气滞、湿浊作祟。该疾病的发展进程首先是胰岛素反抗和肥胖，继而出现脂代谢异样、2型糖尿病及其并发症。胰岛素反抗在整个病程的发展中起着关键性作用，是代谢综合征中各种临床症状共同的病理生理基础。中医方剂功效是方内药物共同作用于机体产生的综合效应。运用辩证的思维针对病机的关键环节，进行合理组方，整体调整,既有利于疾病治疗，乂可使方剂作用于机体发挥最佳的调整作用，与现代医学多靶点作用的网络药理学相吻合。中药红景天富含多种微量元素和第基酸，具有抗胰岛素反抗、抗苍老、抗有害刺激、抗肿瘤及爱护心血管等作用：蛹虫草具有和冬虫夏草相像的活性成分和药理作用，其主要成分之一虫草素具有肯定降低血脂的作用；大黄酸属单,葱核类1.8-二羟基慈醍衍生物，它能抑制脂肪细胞的分化和脂肪细胞合成，并对糖尿病肾病具有爱护作用，具有肯定的改善的萄糖耐量、增加胰岛素敏感性和爱护胰岛功能的作用。本文遵循中医治疗消渴症的补气、益精、清热、活血、化痰等基本原则，运用现代医学的探讨技术，结合中医辨证论治的理论和中药多靶点作用的优势，分别以腆岛素、瘦素信号传导通路共同的负调整因子蛋白酪氨酸磷酸酶IB(proteintyrosinephosphataseIB,I1TP1.B)和延缓糖汲取的-韵萄糖昔前(-g1.ucosidase)作为探讨靶点,在运用中药有效部位抑制分子靶点和调整高胆固醉血症的基础上，探究了治疗代谢综合征的中药新复方景丹胰敏剂(JD)的药材选择和复方的组成、配比及其有效剂量。1材料红兔天、蛹虫草、大黄等药材均购自北京同仁堂,由中国医学科学院药物探讨所自然产物化学探讨室鉴定、制备提取物。罗格列酮购自北京高盟化工有限公司：总胆固酢测定试剂盒为中生北控生物科技股份有限公司产品：中性胰岛素注射液产H美国1.I1.Y公司；前萄糖等其他试剂均为分析纯试剂，购自北京北化精细化学品有限责任公司。雄性4周龄C57B1./6J小鼠购自北京维通利华试验动物技术有限公司，合格证号SCXK(京)2006-0009,以自制的高脂高糖饲料诱导21周，形成胰岛素反抗合并高胆固醉血症的肥胖小鼠模型(IRF)e综合考虑动物的胰岛素耐量、血TC水平和体重等因素，将模型动物随机分成模型比照(IRF)组、阳性药比照(Rosi)组、受试药(JD)组。同时设同批正常小鼠作为正常比照(Con)组。动物饲养于中国医学科学院药物探讨所试验动物中心二级动物房,设施合格证SYXK(京)2009-0001o试验动物自由摄食饮水，饲养温度2122C,湿度40%60船光照/黑暗时间为12h12h三试验过程符合北京市试验动物管理条例等试验动物道德伦理的相关规定。阳性比照药物选用胰岛素增敏剂罗格列酮(rosig1.i1.azonc,Rosi),口服剂量为10mg7kg-1.1,2方法2.1葡萄糖耐量试验(g1.ueOSeIo1.erance1.est,GTF)动物禁食2h后，腹腔注射锚萄糖IgVkg-I体重，分别于葡萄糖负荷后0,30,60,120min经尾尖取血，测定血糖水平，并计算血糖-时间曲线下面积(areaundercurve,UCIPGTT)o2.2 胰岛素耐量试验(insu1.into1.erancetest,ITY)动物禁食2h后，皮下注射胰岛素0.26U?kg-1.体重，分别于胰岛素负荷后0,30,60,120min经尾尖取血,测定血糖水平，并计算血糖-时间曲线下面积AUCITTo2.3 生化指标的测定采纳葡萄糖氧化酶法测定血糖水平。按总胆固醇测定试剂盒说明书测定血清TC水平。利用B1.21Escherichiaco1.i大肠杆菌扩增基因重组人PTP1.B蛋白,并应用GST亲和色谱柱纯化PTP1.B蛋白。以硝基磷酸盐为底物，进行PTP1.B的腑学反应，视察药物对PTPIB蛋白活性的影响。化学物质p-nitrophcny1-a1pha-D-g1.Ucopyranoside（PNPG）经-葡萄糖昔酶催化生成前萄糖和p-nitro-pheny,后者可在400nm处有最大汲取峰。依据此原理，以PNPG为底物，检测样品对-前萄糖甘酶活性的影响。采纳GDH（甘油酸脱氢酶）法测定GFAT醯活性。2.4 统计学方法试验数据以XS表示。正交试验采纳SAS软件ANOVAProcedure方法进行方差分析。组间比较应用SPSS13.0软件,采纳One-wayANOVA进行统计学处理。P-I的剂量灌胃给药，连续给药Hd,视察其调整血TC水平的作用。结果显示，样品Y6,Y8,Y1.O,Y12药效相像，分别使IRF模型小鼠血TC水平降低53.2%,57.1%,58.1%,55.6%。综合考虑各样品的提取率和提取工艺，选择样品Y12为方剂组分（图1）。大黄酸具有明显抑制谷冗酸果糖氨基转移曲（GFAT）活性的作用，其IC50为2.5610-6mo1.?1.-1.,故选用富含大黄酸的样品D作为方剂的组分（图2）。3.2 方剂组成分的协同作用将样品H13,Y12,D分别进行组合，视察方剂中各组分在改善胰岛素反抗和高胆固醉血症方面的协同作用（表3）。结果显示，连续给药IOd后，各成分的组和改善ITT作用强度的依次为JD16Y12JD14JD15H13（图3A,B）：连续给药1.6d后，各成分的组和改善IGT作用强度的依次为JD16JD14Y12JD15H13（图3C,D）连续给药16d后，各成分的组和改善高TC血症作用强度的依次为JD16JD14Y12JD15H13（图3E）结果显示，组分H13,Y12,D在改善IRF模型小鼠胰岛素耐量、锚萄精耐量和高胆固醇血症方面，具有较好的协同作用。3.3 方剂中各组分之最佳配比的探讨在确定JD组分的基础上，为了选择方剂中各组分的最佳配比，设计了考虑交互作用的3因素2水平的1.8（27）正交试验，并按正交设计方案分别测定了8种不同组安排比的样品对PTP1.B和-前萄糖甘酶抑制作用的IC50（表4）。采纳SAS软件NOVProcedure方法进行方差分析，结果显示，针对靶点PTP1.B,因素h和d,d和y的交互作用对该靶点的活性无明显作用（表5）o去掉因素hd和因素dy再进行方差分析的结果显示，针对靶点FFP1.B,因素h显示明显的相关性.计算各因素各水平的平均值和标准差，可见针对靶点PTPIB的方剂最佳组合为h,y,d,（表6）。针对靶点-葡萄糖甘酶，因素h和d,d和y的交互作用对该靶点的活性无明显作用（表5）。因素h和因素d均显示明显的相关性，其影响程度为因素h因素d.针对靶点-葡萄糖甘酶的方剂最佳组合为h2y2d1.o考虑到因素d对靶点-萄糖甘酶具有明显相关性，而对靶点IyTP1.B则无明显作用，故选择h2y2d1.作为方剂中各组分的最佳配比,BPH13：Y12：D=20：1：1,与方剂JD16的配比一样。3.4 方剂JD16改善小鼠代谢综合征有效剂量的探讨将IRF模型小鼠随机分成6组：模型比照IRF组、阳性药Rosi组和方剂JD16-100,JD16-200,JD16-400,JD16-600组，分别灌胃赐予水、罗格列酮IOmg?kgT和方剂JD16100,200,400,600mg7kg-1.三同时设同批正常小鼠为正常比照Con组。连续给药7d,进行腹腔注射的萄糖耐量试验，并计算血糖-时间曲线下面积AUC1.PGTT；连续给药IOd,测定血TC水平。结果显示,与IRF组比较,JD16T果,JD16-200,JD16-400,jdi6-600组Aucipgtt分别降低了显示,jdi6改善irf小鼠代谢综合征作用的最低有效剂量为100mg?kgT,最佳有效剂量为200mg?kg-1.O-4探讨中医理论的墙体调整是方剂作用的主要方式，以君、臣、佐使配伍原则，使方剂中各组分联结成一个新的有机整体，对机体共同发挥最大的调整作用，正如徐灵胎所谓药有特性之特长，方有合群之妙用，从而达到方之既成，能使药各全其性，亦能使药各失其性。胰岛素反抗是2型糠尿病等代谢综合征的共同的病理生理基础，分子靶点PTP1.B是胰岛素增敏剂潜在的作用靶点之一。-葡萄糖甘酶是经典的抗糖尿病药物作用靶点。体内能量代谢感受器GFAT是糖尿病并发症发生发展的重要因子。本探讨是以具有胰岛素反抗、高胆固醇血症、糖耐量低减、肥胖等代谢综合征病理特征的IRF小鼠模型为探讨对象，以分子靶点PTP1.B和-葡萄糖针酶为切入点，以中药药性理论为基础，遵循方剂配伍理论，针对病机的关键环节，绽开塔丹胰敏剂的方剂学探讨。景丹胰敏剂的主要成分红景天补气清肺，化淤养心，且具有很好的PTP1.B和-葡萄糖昔酶抑制作用，可明显增加IRF小鼠的胰岛素敏感性、改善其糖耐量低减和高胆固醉血症，为君药：蛹虫草味甘性温，补肺气,益肾精,化痰浊,强腰膝,与红景天配伍,增加补益肺肾之功，降低血总胆固醉的功效，为臣药：大黄沟热解毒，逐瘀通经，具有较强的抑制GFAT酶活性，与君臣药物相配，改善糖代谢、减缓糖尿病并发症的发生，发挥其祛逐邪毒淤滞之功为佐使药，三药配伍共凑补气、益精、清热、活血、化瘀之功效。本试验分别以对分子靶点PTPIB和-葡萄糖甘梅的抑制作用、对小鼠高胆固醇血症改善作用和对分子靶点GFAT的抑制活性为视察手段，选择了红景天、蛹虫草和大黄的药材种类、产地和提取部位，确定的组成成分为红兔天HI3、蛹虫草Y12和大黄D；并以改善IRF小鼠胰岛素反抗和高胆固静血症的协同作用确定中药新配方为景丹胰敏剂JDI6。正交试验设计是依据正交性从全面试验中选择出部分有代表性的点进行试验，这些有代表性的点具备了匀称分散，齐整可比的特点，是探讨多因素多水