霍乱弧菌的分离与鉴定、霍乱诊断的相关实验技术、鉴别诊断.docx

附录A（规范性）霍乱弧菌的分盅与鉴定A.1标本的采集患者的粪便、呕吐物或（和）肛拭子为适宜采集的标本.水样使或呕吐物采样St一股为1m1.-3m1.成形便采取指甲大小的蕤6：IIHK干可用直肠棉状或采使管曲肛门插入直肠内3Cm5cm（幼儿约2cm-3cm）处旋转后取出，以看到棉拭子上沾有粪便为佳。也可采集患不口常生活物品的涂抹拭子标本和家居环境的样本。A.2标本的送检果得的标本应立即接种F培养基，不能立即接种的，应放入PH8.49.2的减性蛋白陈水或义睹：氏保存液或插入Caiy-BkIir半固体保存培养基中,放置于冷藏箱内保存、送检。粪便或呕吐物等标本与运送培养基或增菌液的比例约为EO.肛拭子他插入5m1.运送培养基或增菌液中.A.3分离培养A.3.1直接分离培养对急性期忠者水样便标本在进行增苗培养的同时，可取-接种环或用股拭产宜接划线接种强、弱选择性平板各一个，宜37C培养18h24h.A.3.2增前分离培养标本接种于pH8.49.2的碱性蛋臼脓水中置37C增菌6h8h后，从菌股下表层取一接种环培养物划税接种于强、如选择性平板各一个，跣37P培养18h24h,必要时可取0.1ml.一次增衡的表层培养物于5m1.的新鲜碱性强臼豚水中进行：次增苗培养，也可选用分离效果较好的蛆崩显色琼脂。A.3.3选择性培养基常用强选择性培养班包括庆大毒素琼脂、硫代硫酸盐柠檬酸盐胆盐或助（TCBS）琼膈和四号球厢等。弱选择性培养基一般使用碱性营养琼脂等.A.3.4霍乱皿菌菌落特征A.3.4.1碱性营养琼脂一乱弧菌今赫性营养琼脂上37<i,VlXh24h'；为无色、网形、透明或半透明、表面光冰润湿、幅平或梢凸起、边缘胫齐的南落,菌落直径一般约为2mm.A.3.4,2庆大霉素琼脂和四号凉脂霍乱弧菌在庆大般素琼脂和四号琼脂上的菌落大小和形态特征与碱性营养球器上的菌落特征相似.但透明性略差，多呈半透明状，菌落中央常呈灰色或灰黑色，弁的培养时间的延长而加深.A.3.4.3TCBS琼脂能乱孤的在TCBS琼脂上生长呈现为黄色发亮、表而光滑、润湿、桶凸起、边域整齐的菌落.A.3.4.4弧菌显色琼脂霍乱弧菌在弧菌显色琼脂上生长菌落呈现特征性的颜色,不同品牌的弧菌显色琼相落落颜色不同.具体参考厂家说明.A.4菌株鉴定A.4.1菌株初筛A.4.1.1玻片凝集试验从选择性平板上挑取疑似菌落接种于普通营养琼脂,37C培养18h-24h后取纯培养物与霍乱弧菌Ol群多价血清和0139群清做玻片凝集,进行01群和0139群隹乱弧菌的初筛.在Imin内出现肉眼可见的明显凝集颗粒，但在生理盐水巾不产生凝集者为阳性，在Imin内不出现凝集颗粒者判为凝集阴性.01群的株应进一步用小川和稻叶血清型特异性的诊断由清做坡片凝娘确定血清型别。破片凝集成脸中需要注意以下方面：a）使用的IhI清效价范围及结果判定参考厂家说明书：b）碱性营养琼脂、庆大许素琼脂及四号琼淅上的疑似菌落如足膨大，可直接挑取疑似菌落进行成片凝佻试验.但TCBS培养基上的疑似菌常常因培格基中海轴的影响造成难以乳化，不宜宜接进行玻片凝集试验，应挑取可疑南落，先接种普通琼脂纯培养后再作玻片凝柒：c）同一标本存在01群和0139群笊乱弧薄混合感染的UJ能，每份标本挑选不低于S个的疑似阳常逐一进行签定。干粉血清也Ur以配制Ol群和0139群混合多价进行初婶,A.4.1.2氧化的试验用钿金环或牙签取生长在普通琼脂或其他无砍水化合物成价的非选择性培养基上的新鲜培养物涂抹在清洁的漉纸上,然后滴加2滴一3滴1%盐酸四甲基对藻：胺水溶液或商品化试剂,如培养物在20s内出现紫红或紫蓝色，有的呈紫黑色,判断为氧化酬试验阳性，不显色判为阴性，A.4.1,3产赤株检测通过检测CT毒素的第料基因CrXA8来确认是否为产毒株.按附录B“A.4.2菌株保存和上送曲株运送和保存应符合国家有关规定。经初筛阳性或可疑阳性的菌株,在发出初步签定报告的同时,应尽快送当地疾病模防控制中心进行更核鉴定现核结果符合Ol群或0139群霍乱弧菌产毒株的葡株.按菌株管理的要求进行保存与上送：如虹核结果出现疑问，应尽快将菌株上送省级或省级以上疾病预防控制中心（参比实验室）迸行确认分析。A. 4.3Sj株复核菌株的复核鉴定应以纯培养物为基础，至少应包括以下项目：平兰染色、黏丝试验、氧化筋试验、血清分型、动力试骁、CT正素基因检测（按附录B）,也可选择生化耗定条或全自动澈生物生化器定系统。凝集反应不典型或者怀疑为彦岛型的南株液增强试管凝集试监,苗椽血清柝的膝定也可用蜃合触法式反应（PCR）方法扩增Ol群和0139血清群脂多树特异性基因力来确定（按附录B）。A.5霍乱强菌系统生化鉴定笊乱弧曲的系统生化鉴定按衣A.I进行。表AT部分弧茵科细菌的系统生化器定JR目布乱如演拟态弧荫副溶血XS创伤丸商溶彼弧曲河克丽弗尼斯（S淘鱼雷利斯弧曲麦氏萤茵辛辛那爽弧两就鱼找脩收适生长也rtrtC373737373737372525.3637253537MftIW÷÷4÷÷4÷.4粘纹实收1，+÷+KW÷÷4÷÷4VP试验林.-.-W尿索的+-+-(I-WUfK+÷÷.+小+÷I."/-.÷林-1.-W¾B-+÷+A-fi45精产气->-÷*JR目秘乱弥蔺拟态弧荫副溶血贝荫创伤溶笈JtBi何弧菌弗尼斯贝荫野鱼孤苗东利财强丽麦氏萤而辛辛那臾弧的ffi乳我*÷A-.-林-史芽他+-+.D-IIJSB÷4-÷÷*÷*诙琳-+w1,网公的M-.+-轩舞:他-+-+.7+-水物素.-*IVltI家+÷+-不斑脉中长½在同量水生试0%NaC+-3%NaCI+÷+6%NaO+/-+A*+/-+*/-*+A÷÷8%NaCI÷4?*A*10%NaCl-林-*-07129IftAXIOWlS-SRSRRRSRSRR性50gS3SSSSSSSSSSS注：SttlS:Rtl.,芹分0139样在乱W苗为抗性R.附录B(规亮性)霍乱诊断的相关实验技术1.1 8乱弧菌特异性核酸PCR检测8.1.1检测能标基因CT幸素是很乱弧苗的主要致病因子，对其编码法因"8的松测可用于对般乱弧的产毒株的确认，瑞株血清群的检测也可用PCR方法如增Ol群和0139群霍乱弧赭脂多胞特异性基因力来确定.种特异性基因位点的PCR扩增也可纳入很乱弧曲的检溯签定中,检测应在符合PCR检测要求的实脸室中进行，实时英光PCR方法较普通PCR操作更简便,可避免交叉污染.8. 1.2样品核酸制备B. 1.2.1粪便'嗯吐物或肛拭子标本用商品化的核酸提取试剂盒提取费便、呕吐物或肛拭子标本中的细菌核酸作为PCR检测模板,标本前处理和核酸提取操作方法参照相应武剂向说明书。8.1.2.2疑似菌落挑取庆大毒素等选择性琼脂或普通营养琼脂等平板上的I个2个可疑的落，以Im1.生理盐水桶锌后，用核酸提取试剂盒提取DNA作为PCR检测模板，另一个皆代方法是将1个2个可疑的落于2001.纯水中煮沸Iomin,冰浴5min,100OONmin-12OOOr/min4T离心5min,取21.-31.上清液作为检测模板.B.1.2.3碱性蛋白陈水母苗培养液从墙曲培养液液体表面前膜卜缘处取Im1.-2m1.的培养液，100rmin-l20rmin离心3min,弃上清沉淀用Im1.纯水垂悬.用核酸提取试剂盒提取DNA作为PcR检测模板.另一个替代方法是沉淀用Im1.纯水更悬、再离心、洗涤2次后,加1001.2OQH1.纯水奠悬煮沸Iomin,冰浴5min,100OOrZmm-12(X)Ormin4匕而心5min,取上消液作为检测的模板.B.1.3普通PCR检测B.1.3.1CT毒素基因检测检测CT毒泰龙因SS8的参照引物序列见表B.1,如增参数：预变性94C,Smin：94C.30s.60'C.30s.72C,30s,30个循环：最后72CiI伸7min.B.1.3.201/0139群发乱弧菌的多糖4寺异性r)h基因检测扩增O1.gI39群的乱弧曲脂多题特异性砂基因的参照引物序列见表B.I,扩增参数；预变性94.5min：94C.30s.55T.30s.72C.45s.3()个循环：最后72C廷伸5min.8.1.3.3霍乱皿函种特异性MyA基因检测扩墙很乱弧尚种特异性UyA基因序列的参照引物序列见表氏1,扩增参数:预变性94r.5min；94C.30s.55r.30s,72,C.45s.30个循环：最后72C延伸5min.表Bl看乱弧菌普通PCR检测叁照引物检测基闪引构石你核汗酸序列(5寸)产构大小pctxRCUA-PICTCAGACGGGATrTGTTAGGCACG302CIAAP2TCrATC150TAGCCCCrAnAcGOlrfbOIrfbPIGECACTGA八CAGATGGG192Olrfb-P2Ggtcatctgtaagtacaac检测雄闪用物名称悔甘?F广列¢5-3,)!“的大小Jbp01399OI3MbPlAgcctctttattacgggtgg449O139rlb-P2GTCAAACCCGArCGTAAAIiGMyAhlvPIGCAAACAGCGAAACAAATACC497hlyAP2TccaccccaccagtcaccB.1.4实时荧光PCR检测B.1.4.1商品化实时PCR检测试剂盒选择使用经国家药品监籽管理机构批准的商品化实时荧光PCR检测试剂B.